搜索
ICS65.020CCSB05DB22吉林省地方标准DB22/T3455—2023分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测实时荧光PCR法Detectionofonionyellowdwarfvirusbyreal-timePCRonShallot2023-02-27发布2023-03-27实施吉林省市场监督管理厅发布学兔兔—2023I前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》和GB/T20001.4—2015《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的规定起草。请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：吉林省农业科学院。本文件主要起草人：李小宇、张春雨、王海鹏、王永志、苏颖、李建平、张金花、杨阳、于红。学兔兔—XXXX1分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒检测实时荧光PCR法警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1范围本文件描述了分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒实时荧光PCR检测方法。本文件适用于分蘖洋葱中洋葱黄矮病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过中文的规范性引用而构成本文件的必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T28067甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法3术语和定义GB/T28067界定的术语和定义适用于本文件。4原理比对洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因，设计一对仅在洋葱黄矮病毒外壳蛋白基因间保守的特异性引物。提取分蘖洋葱总RNA，在反转录酶作用下反转录成cDNA，并以其为模板，利用Taq酶进行实时荧光PCR扩增反应（采用SYBRGreenⅠ荧光染料方法）。SYBRGreenⅠ是一种具有绿色激发波长的染料，能够与双链DNA小沟区域结合。游离状态的SYBRGreenⅠ只发出微弱的荧光，当与双链DNA结合后，荧光强度会显著增加，而且荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。5试剂或材料5.1试剂5.1.1水：符合GB/T6682-2008中一级水的要求。5.1.2Trizol核酸提取试剂盒。5.1.3反转录试剂盒。5.1.4实时荧光PCR试剂盒。5.1.5DEPC（焦炭酸二乙酯DiethyPyrocarbonate）。5.1.6三氯甲烷。学兔兔—XXXX25.1.7异丙醇。5.1.8无水乙醇。5.1.9DEPC处理的水。5.1.10DEPC处理的75%乙醇：无水乙醇（含量≥99.8%）与DEPC处理的水按3︰1的体积比配置。5.2引物5.2.1引物序列上游引物：5′-GCACGTTACGCATTCGACTT-3′下游引物：5′-GCCTTCATCTGCATGTGTG-3′5.2.2引物配制引物用水稀释成10μmol/L，-20℃保存备用。6仪器设备6.1实时荧光PCR仪。6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.3电子天平：感量0.01g。6.4高速冷冻离心机：离心力12000g以上。6.5微量移液器：0.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。6.6恒温水浴锅。6.7冰箱：4℃，-20℃，-80℃。6.8离心管：DEPC处理，1.5mL。6.9实时荧光PCR反应管：DEPC处理，200μL。7样品7.1对照样品7.1.1阳性样品用已知含有洋葱黄矮病毒的新鲜管状叶作为阳性样品。7.1.2阴性样品用已知不含有洋葱黄矮病毒的新鲜管状叶作为阴性样品。7.2试样采集新鲜管状叶为宜，也可采集地下鳞茎。装入密封袋，置于冰盒中，4℃保存不超过12h，也可-80℃长期保存。8操作步骤8.1RNA提取学兔兔—XXXX38.1.1离心管、药匙等经液氮预冷。8.1.2称取0.1g样品液氮充分研磨（检测鳞茎时，选择中部层取样。），转入0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）处理的1.5mL离心管中，立即加1mLTrizol试剂，混匀，室温裂解5min。8.1.3加200μL氯仿，充分摇晃混匀15s，室温静置2min～3min，4℃12000r/min离心15min，取上层溶液转入新的DEPC处理的1.5mL离心管中。8.1.4加0.5mL异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃12000r/min离心10min，弃上清。8.1.5加1mLDEPC处理的75%乙醇，涡旋震荡1min，4℃12000r/min离心5min，弃上清。8.1.6离心管开盖晾5min～10min至管壁和管盖无液体，加入40μLDEPC水，混匀溶解，直接进行下步操作或-80℃保存备用。8.1.7用核酸蛋白分析仪测定RNA浓度。8.2反转录8.2.1利用反转录试剂盒合成cDNA第一链，反应体系见表1、表2。表1反应体系-1试剂体积μL随机的6核苷酸引物1dNTP混合溶液(10mmol/L)1模板RNA2.5rnasefreeddH2O5.5表2反应体系-2试剂体积μL上述变性后反应液105×PrimeScriptⅡBuffer4rnaseinhibitor(40U/μL)0.5primeScriptⅡRTase(200U/μL)1rnasefreeddH2O4.58.2.2反应程序8.2.2.1反应体系-1，65℃温浴5min，冰浴冷却备用。8.2.2.2反应体系-2，30℃10min后42℃1h。8.3实时荧光PCR反应8.3.1实时荧光PCR反应体系见表3。学兔兔—XXXX4表3反应体系试剂剂量μL终浓度2×MagicSYBRMixtrue101×上游引物（10μM）0.60.3μM下游引物（10μM）0.60.3μMcDNA210ng～200ngddH2O补齐至208.3.2反应程序预变性95℃5min，变性95℃30s，退火延伸60℃15s，40个循环。9试数据处理9.1结果分析条件设定读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，结果呈阴性为准。9.2检测结果的判定根据Ct值判定检测结果，在阳性对照、阴性对照和空白对照检测结果与预期一致的前提下：a)检测样品的Ct值小于35，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性。b)检测样品的Ct值介于35～40，且出现特定的扩增曲线，需重新进行实时荧光PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35～40，且出现特定的扩增曲线，判定结果为阳性；否则判为阴性。c)检测样品的Ct值大于40，或未出现特定的扩增曲线，判定结果为阴性。10试验报告试验报告至少应给出以下几个方面的内容：a)试验对象；b)所使用的标准；c)所使用的方法；d)结果；e)观察到的异常现象；f)试验日期。_________________________________学兔兔标准下载