农业农村部公告第627号-2-2022 饲料中二羟丙茶碱的测定 液相色谱-串联质谱法

20221219发布－－20230301－－实施饲料中二羟丙茶碱的测定液相色谱-串联质谱法46中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.120BDeterminationofdiprophyllineinfeeds—Liquidchromatography-tandemmassspectrometry中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第627号—2—2022CCS农业农村部公告第６２７号—２—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口.本文件起草单位:四川省饲料工作总站[农业农村部饲料质量监督检验测试中心(成都)].本文件主要起草人:赵立军、张静、李云、冯波、高庆军、晁娟娟、李丽、蒋刘柱、林顺全.Ⅰ农业农村部公告第６２７号—２—２０２２饲料中二羟丙茶碱的测定　液相色谱Ｇ串联质谱法１　范围本文件规定了饲料中二羟丙茶碱的液相色谱Ｇ串联质谱测定方法.本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中二羟丙茶碱的测定.本文件的检出限为０􀆰０１mg/kg,定量限为０􀆰０５mg/kg.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法GB/T２０１９５　动物饲料　试样的制备３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理试样中的二羟丙茶碱用甲酸溶液提取,经固相萃取柱净化,用液相色谱Ｇ串联质谱仪测定,基质匹配标准溶液校准,外标法定量.５　试剂或材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂.５􀆰１　水:GB/T６６８２,一级.５􀆰２　甲醇:色谱纯.５􀆰３　甲酸:色谱纯.５􀆰４　乙酸铵:色谱纯.５􀆰５　２５％甲醇溶液:取甲醇２５０mL,加水稀释至１L,混匀.５􀆰６　０􀆰２％甲酸溶液:取甲酸２mL,加水稀释至１L,混匀.５􀆰７　乙酸铵溶液(２００mmol/L):称取乙酸铵３􀆰１g,加水溶解并稀释至２００mL,混匀.５􀆰８　乙酸铵Ｇ甲酸溶液:移取乙酸铵溶液(５􀆰７)１２􀆰５mL和甲酸１mL,加水定容至５００mL,混匀.５􀆰９　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取二羟丙茶碱标准品(CAS号:４７９Ｇ１８Ｇ５,纯度不低于９８％)５０mg(精确至０􀆰０１mg)于５０mL容量瓶中,用２５％甲醇溶液(５􀆰５)溶解定容.于２℃~８℃保存,有效期为３个月.５􀆰１０　标准中间溶液(１０μg/mL):准确移取二羟丙茶碱标准储备溶液(５􀆰９)１mL于１００mL容量瓶中,用甲醇(５􀆰２)稀释至刻度,混匀.于２℃~８℃保存,有效期为１个月.５􀆰１１　固相萃取柱:混合型阳离子交换柱,６０mg/３mL,或性能相当者.５􀆰１２　微孔滤膜:０􀆰２２μm,水系.６　仪器设备６􀆰１　液相色谱Ｇ串联质谱仪:配电喷雾离子源.１农业农村部公告第６２７号—２—２０２２６􀆰２　分析天平:感量０􀆰１mg和０􀆰０１mg.６􀆰３　离心机:转速不低于８０００r/min.６􀆰４　往复式振荡器.６􀆰５　固相萃取装置.６􀆰６　涡旋混合器.６􀆰７　氮吹仪.７　样品按GB/T２０１９５的规定制备试样,至少２００g,粉碎后通过０􀆰４２５mm孔筛,充分混匀,装入容器,密闭保存,备用.选取类型相同,均匀一致、且在待测物保留时间处,仪器响应值小于方法定量限３０％的饲料样品,作为空白试样.８　试验步骤８􀆰１　提取平行做２份试验.称取试样２g(精确至０􀆰０００１g),于５０mL离心管中,准确加入２０mL０􀆰２％甲酸溶液(５􀆰６),摇匀,振荡２０min,以８０００r/min离心５min,移取上清液作为备用液.８􀆰２　净化８􀆰２􀆰１　配合饲料、浓缩饲料和精料补充料:将固相萃取柱依次用３mL甲醇(５􀆰２)、３mL水活化.准确移取５mL备用液(８􀆰１)过柱,用３mL水淋洗,抽干,再用３mL甲醇(５􀆰２)洗脱,收集洗脱液,于５０℃氮吹至干,准确加入１mL０􀆰２％甲酸溶液(５􀆰６)溶解,涡旋混匀,过０􀆰２２μm微孔滤膜(５􀆰１２),备用.８􀆰２􀆰２　添加剂预混合饲料:取适量备用液(８􀆰１)过０􀆰２２μm微孔滤膜(５􀆰１２)２次,备用.８􀆰３　基质匹配标准系列溶液的制备取空白试样,按８􀆰１和８􀆰２处理得到空白基质溶液,取适量标准中间溶液(５􀆰１０),用甲醇配制成浓度分别为２􀆰０ng/mL、５􀆰０ng/mL、２５􀆰０ng/mL、５０􀆰０ng/mL、１００􀆰０ng/mL、２００􀆰０ng/mL、５００􀆰０ng/mL的标准系列溶液,各取１mL于５０℃氮吹至干,准确加入１mL空白基质溶液,涡旋混匀,待测.８􀆰４　测定８􀆰４􀆰１　液相色谱参考条件色谱柱:C１８柱,柱长５０mm,内径２􀆰１mm,粒径１􀆰８μm,或性能相当者.流动相A:甲醇(５􀆰２);流动相B:乙酸铵Ｇ甲酸溶液(５􀆰８).梯度洗脱条件见表１.表１　梯度洗脱条件时间,minA相,％B相,％０１５８５０􀆰５０１５８５２􀆰５０９５５３􀆰２０９８２４􀆰２０９８２４􀆰２１１５８５６􀆰５０１５８５流速:０􀆰３mL/min.柱温:３０℃.进样量:２μL.８􀆰４􀆰２　质谱参考条件电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI＋).检测方式:多反应监测(MRM).２农业农村部公告第６２７号—２—２０２２毛细管电压:３􀆰５kV.干燥气温度:３００℃.干燥气流速:５L/min.雾化器压力:４５psi.多反应监测(MRM)离子对、碎裂电压和碰撞能量参考值见表２表２　二羟丙茶碱的多反应监测(MRM)离子对、碎裂电压和碰撞能量参考值待测物名称监测离子对,m/z碎裂电压,V碰撞能量,eV二羟丙茶碱２５５􀆰０/１８０􀆰９a３８０２２２５５􀆰０/１２３􀆰９３８０３４　　a　定量离子对.８􀆰４􀆰３　基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液和试样溶液上机测定.基质匹配标准溶液多反应监测色谱图见附录A.８􀆰４􀆰４　定性在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差在±２􀆰５％以内,且试样谱图中二羟丙茶碱定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的定性离子相对离子丰度进行比较,若偏差不超过表３规定的范围,则可判定为试样中存在对应的待测物.表３　定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差单位为百分号相对离子丰度＞５０２０~５０１０~２０≤１０允许的最大偏差±２０±２５±３０±５０８􀆰４􀆰５　定量分别取适量试样溶液和基质匹配标准系列溶液,以浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,标准曲线的相关系数应不低于０􀆰９９.试样溶液与基质匹配标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内,如超出线性范围,应重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液用０􀆰２％甲酸溶液稀释后重新测定.单点校准定量时,试样溶液中待测物的浓度与基质匹配标准溶液浓度相差不超过３０％.９　试验数据处理试样中二羟丙茶碱的含量以质量分数计.标准曲线校准按公式(１)计算;单点校准按公式(２)计算.w＝ρ×V×nm×１０００(１)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺w＝A×Cs×V×nAs×m×１０００(２)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺式中:w———试样中二羟丙茶碱含量的数值,单位为毫克/千克(mg/kg);ρ———由标准曲线得到的试样溶液中二羟丙茶碱质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL);V———最终定容体积的数值,单位为毫升(mL);n———稀释倍数;m———试样质量的数值,单位为克(g);A———试样溶液中二羟丙茶碱的色谱峰面积;Cs———基质匹配标准溶液中二羟丙茶碱质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL);As———基质匹配标准溶液中二羟丙茶碱的色谱峰面积.测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留３位有效数字.３农业农村部公告第６２７号—２—２０２２１０　精密度在重复性条件下,２次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的２０％.４农业农村部公告第６２７号—２—２０２２附　录　A(资料性)二羟丙茶碱基质匹配标准溶液定量离子色谱图　二羟丙茶碱基质匹配标准溶液定量离子色谱图见图A􀆰１.图A􀆰１　二羟丙茶碱基质匹配标准溶液(１００􀆰０ng/mL)定量离子色谱图５