农业农村部公告第628号-9-2022 转基因植物及其产品成分检测 大豆常见转基因成分筛查

20221219发布－－20230301－－实施转基因植物及其产品成分检测大豆常见转基因成分筛查04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020.01BDetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—Screeningofcommongeneticallymodifiedcomponentsinsoybean中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号—9—2022CCS农业农村部公告第６２８号—９—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、山西农业大学.本文件主要起草人:高建华、张秀杰、史宗勇、陈子言、刘璇、许冬梅、张雨琪、李夏莹、梁晋刚、王颢潜、郭俊佩、赵娟丽.Ⅰ农业农村部公告第６２８号—９—２０２２转基因植物及其产品成分检测大豆常见转基因成分筛查１　范围本文件规定了大豆中常见转基因成分的定性筛查方法.本文件适用于１６种转基因大豆转化体(见附录A)及其加工产品中常见转基因成分(CaMV３５S启动子、NOS终止子、pat基因、cry１Ac基因和E９终止子)的定性筛查.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件,不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.农业部１４８５号公告—４—２０１０　转基因植物及其产品成分检测　DNA提取和纯化农业部２０３１号公告—１９—２０１３　转基因植物及其产品成分检测　抽样NY/T６７２　转基因植物及其产品检测　通用要求３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１Lectin基因　Lectingene编码大豆凝集素Lectin的基因,本文件中作为大豆内标准基因.３􀆰２CaMV３５S启动子　３５Spromoterfromcauliflowermosaicvirus来自花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)的３５S启动子.３􀆰３NOS终止子　terminatorofnopalinesynthasegene来自胭脂碱合成酶(nopalinesynthase)基因的终止子.３􀆰４pat基因　phosphinothricinacetyltransferasegene来源于绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothriＧcinacetyltransferase,PAT).３􀆰５cry１Ac基因　cry１Acgene编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)cry１Ac杀虫晶体蛋白的基因.３􀆰６E９终止子　terminatorofribuloseＧ１,５Ｇbiphosphatecarboxylasesmallsubunit来自豌豆核酮糖１,５Ｇ二磷酸羧化酶小亚基(ribuloseＧ１,５Ｇbiphosphatecarboxylasesmallsubunit)基因的３′端终止序列.４　原理依据１６种转基因大豆转化体中常见的５种调控元件和基因序列,选择特异性引物及探针,对试样进行１农业农村部公告第６２８号—９—２０２２PCR扩增.依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型扩增曲线,判断样品中是否含有相应的转基因成分.５　试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水.５􀆰１　琼脂糖.５􀆰２　１０g/L溴化乙锭(EB)溶液:称取１􀆰０g溴化乙锭,溶解于１００mL水中,避光保存.警告———溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物.注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂.５􀆰３　１０mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液:在１６０mL水中加入８０􀆰０g氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容到２００mL.５􀆰４　５００mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２)溶液(pH８􀆰０):称取１８􀆰６g乙二胺四乙酸二钠,加入７０mL水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见５􀆰３)直至EDTAＧNa２完全溶解,用氢氧化钠溶液(见５􀆰３)调pH至８􀆰０,加水定容至１００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰５　１mol/L三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸(TrisＧHCl)溶液(pH８􀆰０):称取１２１􀆰１g三羟甲基氨基甲烷溶解于８００mL水中,用盐酸调pH至８􀆰０,加水定容至１０００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰６　TE缓冲液(pH８􀆰０):分别量取１０mL三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸溶液(见５􀆰５)和２mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见５􀆰４),加水定容至１０００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰７　５０×TAE缓冲液:称取２４２􀆰２g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用５００mL水加热搅拌溶解后,加入１００mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见５􀆰４),用冰乙酸调pH至８􀆰０,然后加水定容到１０００mL.使用时用水稀释成１×TAE.５􀆰８　加样缓冲液:称取２５０􀆰０mg溴酚蓝,加入１０mL水,在室温下溶解１２h;称取２５０􀆰０mg二甲基苯腈蓝,加１０mL水溶解;称取５０􀆰０g蔗糖,加３０mL水溶解.混合以上３种溶液,加水定容至１００mL,在４℃下保存.５􀆰９　DNA分子量标准:可以清楚区分１００bp~１０００bp的DNA片段.５􀆰１０　dNTPs混合溶液:将浓度为１０mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP４种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.５􀆰１１　TaqDNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及２５mmol/L氯化镁(MgCl２)溶液.５􀆰１２　普通PCR方法引物检测参数的普通PCR方法引物序列及目的片段大小见表１.表１　普通PCR方法引物组合信息表检测参数引物序列(５′Ｇ３′)目的片段大小,bpLectin基因LectinＧFGGGTGAGGATAGGGTTCTCTGLectinＧRGCGATCGAGTAGTGAGAGTCG２１０CaMV３５S启动子PCaMV３５SＧFGCTCCTACAAATGCCATCATTGCPCaMV３５SＧRGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC１９５NOS终止子TNOSＧFGAATCCTGTTGCCGGTCTTGTNOSＧRTTATCCTAGTTTGCGCGCTA１８０pat基因patＧFCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATpatＧRTTCCAGGGCCCAGCGTAAG２２７cry１Ac基因cry１AcＧFGAAGGTTTGAGCAATCTCTACcry１AcＧRCGATCAGCCTAGTAAGGTCGT３０１E９终止子Te９ＧFCGCACACACCAGAATCCTACTGATe９ＧRAGGCCACGATTTGACACA２８５５􀆰１３　实时荧光PCR方法引物和探针检测参数的实时荧光PCR方法引物/探针序列及目的片段大小见表２,探针５′端标记荧光报告基团２农业农村部公告第６２８号—９—２０２２(如FAM、HEX等),３′端标记对应的淬灭基团(如TAMRA、BHQ１等).表２　实时荧光PCR方法引物和探针组合信息表检测参数引物/探针序列(５′Ｇ３′)目的片段大小,bpLectin基因LectinＧqFGCCCTCTACTCCACCCCCALectinＧqRGCCCATCTGCAAGCCTTTTTLectinＧqPAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC１１８CaMV３５S启动子PCaMV３５SＧqFCGACAGTGGTCCCAAAGAPCaMV３５SＧqRAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCPCaMV３５SＧqPTGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC７４NOS终止子TNOSＧqFATCGTTCAAACATTTGGCATNOSＧqRATTGCGGGACTCTAATCATATNOSＧqPCATCGCAAGACCGGCAACAGG１６５pat基因patＧqFGTCGACATGTCTCCGGAGAGpatＧqRGCAACCAACCAAGGGTATCpatＧqPTGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA１９１cry１Ac基因cry１AcＧqFGACCCTCACAGTTTTGGACATTGcry１AcＧqRATTTCTCTGGTAAGTTGGGACACTcry１AcＧqPTCCCGAACTATGACTCCAGAACCTACCCTATCC９３E９终止子Te９ＧqFTCTTGTACCATTTGTTGTGCTTGTTe９ＧqRGGACCATATCATTCATTAACTCTTCTCCTe９ＧqPCGGTTTTCGCTATCGAACTGTGAAATGGAAATGG１０８５􀆰１４　引物/探针溶液:用TE缓冲液(见５􀆰６)或水分别将上述引物或探针稀释到１０μmol/L.５􀆰１５　石蜡油.５􀆰１６　DNA提取试剂盒.５􀆰１７　定性PCR试剂盒.５􀆰１８　PCR产物回收试剂盒.５􀆰１９　实时荧光PCR试剂盒.６　主要仪器和设备６􀆰１　分析天平:感量０􀆰１g和０􀆰１mg.６􀆰２　PCR扩增仪:升降温速度＞１􀆰５℃/s,孔间温度差异＜１􀆰０℃.６􀆰３　实时荧光PCR仪.６􀆰４　电泳槽、电泳仪等电泳装置.６􀆰５　凝胶成像系统或照相系统.７　操作步骤７􀆰１　抽样按NY/T６７２和农业部２０３１号公告—１９—２０１３的规定执行.７􀆰２　试样制备按NY/T６７２和农业部２０３１号公告—１９—２０１３的规定执行.７􀆰３　试样预处理　　按农业部１４８５号公告—４—２０１０的规定执行.７􀆰４　DNA模板制备　　按农业部１４８５号公告—４—２０１０的规定执行.７􀆰５　PCR扩增３农业农村部公告第６２８号—９—２０２２７􀆰５􀆰１　普通PCR方法７􀆰５􀆰１􀆰１　试样PCR扩增７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰１　每个试样PCR扩增设置３个平行.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰２　按表３依次加入反应试剂,混匀,分装到PCR管中,再加２５μL石蜡油(有热盖功能的PCR仪可不加).也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系.表３　普通PCR扩增体系试剂终浓度体积ddH２O—１０×PCR缓冲液１×２􀆰５μL２５mmol/L氯化镁溶液１􀆰５mmol/L１􀆰５μLdNTPs混合溶液(各２􀆰５mmol/L)０􀆰２mmol/L２􀆰０μL１０μmol/L上游引物０􀆰４μmol/L１􀆰０μL１０μmol/L下游引物０􀆰４μmol/L１􀆰０μLTaqDNA聚合酶０􀆰０５U/μL—２５mg/LDNA模板２􀆰０mg/L２􀆰０μL总体积２５􀆰０μL　　“—”表示体积不确定,如果PCR缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据Taq酶的浓度确定其体积,并相应调整ddH２O的体积,使反应体系总体积达到２５􀆰０μL.若采用定性PCR试剂盒,则按试剂盒说明书的推荐用量配制反应体系,但上下游引物用量按表３执行.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰３　将PCR管放在离心机上,５００g~３０００g离心１０s,然后取出PCR管,放入PCR仪中.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰４　进行PCR扩增.反应程序为:９４℃变性５min;９４℃变性３０s,５８℃退火３０s,７２℃延伸３０s,共进行３５次循环;７２℃延伸７min;１０℃保存.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰５　反应结束后取出PCR管,对PCR扩增产物进行电泳检测.７􀆰５􀆰１􀆰２　对照P