农业农村部公告第628号-10-2022 转基因植物及其产品成分检测 油菜常见转基因成分筛查

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20221219发布--20230301--实施转基因植物及其产品成分检测油菜常见转基因成分筛查04中华人民共和国国家标准备案号:XXXX-XXXXICS65.020.01BDetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—Screeningofcommongeneticallymodifiedcomponentsinrapeseed中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号—10—2022CCS农业农村部公告第628号—10—2022前  言本文件按照GB/T1􀆰1—2020«标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所.本文件主要起草人:武玉花、张秀杰、吴刚、陈子言、李俊、高鸿飞、李允静、肖芳、翟杉杉.Ⅰ农业农村部公告第628号—10—2022转基因植物及其产品成分检测油菜常见转基因成分筛查1 范围本文件规定了油菜中常见转基因成分的定性筛查方法.本文件适用于11种转基因油菜转化体(见附录A)及其加工产品中常见转基因成分(CaMV35S启动子、FMV35S启动子、NOS终止子、mCP4Gepsps基因、pat基因和bar基因)的定性筛查.2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.农业部1485号公告—4—2010 转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化农业部2031号公告—19—2013 转基因植物及其产品成分检测 抽样NY/T672 转基因植物及其产品检测 通用要求3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件.3􀆰1CruA基因 cruciferinAgene编码储藏蛋白芸薹素基因,在本文件中作为油菜内标准基因.3􀆰2CaMV35S启动子 35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus来自花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)的35S启动子.3􀆰3FMV35S启动子 35Spromoterfromfigwortmosaicvirus来自玄参花叶病毒(figwortmosaicvirus,FMV)的35S启动子.3􀆰4NOS终止子 terminatorofnopalinesynthasegene来自胭脂碱合成酶(nopalinesynthase)基因的终止子.3􀆰5mCP4Gepsps基因 modified5GenolpyruvylshikimateG3Gphosphatesynthasegene来源于土壤农杆菌CP4株系,对核苷酸序列进行了偏好密码子修饰,编码5G烯醇式丙酮酸莽草酸G3G磷酸合成酶(5GenolpyruvylshikimateG3Gphosphatesynthasegene).3􀆰6bar基因 bialaphosresistancegene来源于土壤吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricinacetyltransferase,PAT).3􀆰7pat基因 phosphinothricinacetyltransferasegene来源于绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothriG1农业农村部公告第628号—10—2022cinacetyltransferase,PAT).4 原理依据11种转基因油菜转化体中常见的6种调控元件和基因序列,设计特异性引物及探针,对试样进行PCR扩增.依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型扩增曲线,判断试样中是否含有相应的转基因成分.5 试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水.5􀆰1 琼脂糖.5􀆰2 10g/L溴化乙锭(EB)溶液:称取1􀆰0g溴化乙锭,溶解于100mL水中,避光保存.警告———溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物.注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂.5􀆰3 10mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液:在160mL水中加入80􀆰0g氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容到200mL.5􀆰4 500mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTAGNa2)溶液(pH8􀆰0):称取18􀆰6g乙二胺四乙酸二钠,加入70mL水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见5􀆰3)直至EDTAGNa2完全溶解,用氢氧化钠溶液(见5􀆰3)调pH至8􀆰0,加水定容至100mL.在103􀆰4kPa(121℃)条件下灭菌20min.5􀆰5 1mol/L三羟甲基氨基甲烷G盐酸(TrisGHCl)溶液(pH8􀆰0):称取121􀆰1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中,用盐酸调pH至8􀆰0,加水定容至1000mL.在103􀆰4kPa(121℃)条件下灭菌20min.5􀆰6 TE缓冲液(pH8􀆰0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷G盐酸溶液(见5􀆰5)和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见5􀆰4),加水定容至1000mL.在103􀆰4kPa(121℃)条件下灭菌20min.5􀆰7 50×TAE缓冲液:称取242􀆰2g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加热搅拌溶解后,加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见5􀆰4),用冰乙酸调pH至8􀆰0,然后加水定容到1000mL.使用时用水稀释成1×TAE.5􀆰8 加样缓冲液:称取250􀆰0mg溴酚蓝,加入10mL水,在室温下溶解12h;称取250􀆰0mg二甲基苯腈蓝,加10mL水溶解;称取50􀆰0g蔗糖,加30mL水溶解.混合以上3种溶液,加水定容至100mL,在4℃下保存.5􀆰9 DNA分子量标准:可以清楚区分100bp~1000bp的DNA片段.5􀆰10 dNTPs混合溶液:将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.5􀆰11 TaqDNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25mmol/L氯化镁(MgCl2)溶液.5􀆰12 普通PCR方法引物检测参数的普通PCR方法引物序列及目的片段大小见表1.表1 普通PCR方法引物组合信息表检测参数引物引物序列(5′~3′)目的片段大小,bpCruAcruAGFGGCCAGGGTTTCCGTGATcruAGRCTGGTGGCTGGCTAAATCGA150CaMV35S启动子PCaMV35SGFGCTCCTACAAATGCCATCATTGCPCaMV35SGRGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC195FMV35S启动子PFMV35SGFAAGACATCCACCGAAGACTTAPFMV35SGRAGGACAGCTCTTTTCCACGTT210NOS终止子TNOSGFGAATCCTGTTGCCGGTCTTGTNOSGRTTATCCTAGTTTGCGCGCTA1802农业农村部公告第628号—10—2022表1(续)检测参数引物引物序列(5′~3′)目的片段大小,bpmCP4Gepsps基因mCP4GepspsGFGACTTGCGTGTTCGTTCTTCmCP4GepspsGRAACACCGTTGAGCTTGAGAC204bar基因barGFACAAGCACGGTCAACTTCCbarGRACTCGGCCGTCCAGTCGTA175pat基因patGFCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATpatGRTTCCAGGGCCCAGCGTAAG2275􀆰13 实时荧光PCR方法引物和探针检测参数的实时荧光PCR方法引物/探针序列及目的片段大小见表2.探针5′端标记荧光报告基团(如FAM、HEX等),3′端标记对应的淬灭基团(如TAMRA、BHQ1等).表2 实时荧光PCR方法引物和探针组合信息表检测参数引物/探针引物序列(5′~3′)目的片段大小,bpCruA基因cruAGqFGGCCAGGGTTTCCGTGATcruAGqRCCGTCGTTGTAGAACCATTGGcruAGqPAGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA101CaMV35S启动子PCaMV35SGqFCGACAGTGGTCCCAAAGAPCaMV35SGqRAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCPCaMV35SGqPTGGACCCCCACCCACGAGGAGCATC74FMV35S启动子PFMV35SGqFAAGACATCCACCGAAGACTTAPFMV35SGqRAGGACAGCTCTTTTCCACGTTPFMV35SGqPTGGTCCCCACAAGCCAGCTGCTCGA210NOS终止子TNOSGqFATCGTTCAAACATTTGGCATNOSGqRATTGCGGGACTCTAATCATATNOSGqPCATCGCAAGACCGGCAACAGG165mCP4Gepsps基因mCP4GepspsGqFGTACCTATGGCTTCCGCTCAAGmCP4GepspsGqRAGTCATGATTGGCTCGATAACAGTmCP4GepspsGqPAGTCCGCTGTTCTGCTTGCTGGTCTCA93bar基因barGqFACAAGCACGGTCAACTTCCbarGqRACTCGGCCGTCCAGTCGTAbarGqPCCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG175pat基因patGqFGTCGACATGTCTCCGGAGAGpatGqRGCAACCAACCAAGGGTATCpatGqPTGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAA1915􀆰14 引物/探针溶液:用TE缓冲液(见5􀆰6)或水分别将上述引物或探针稀释到10μmol/L.5􀆰15 石蜡油.5􀆰16 DNA提取试剂盒.5􀆰17 定性PCR试剂盒.5􀆰18 PCR产物回收试剂盒.5􀆰19 实时荧光PCR试剂盒.6 主要仪器和设备6􀆰1 分析天平:感量0􀆰1g和0􀆰1mg.6􀆰2 PCR扩增仪:升降温速度>1􀆰5℃/s,孔间温度差异<1􀆰0℃.6􀆰3 实时荧光PCR仪.6􀆰4 电泳槽、电泳仪等电泳装置.3农业农村部公告第628号—10—20226􀆰5 凝胶成像系统或照相系统.7 操作步骤7􀆰1 抽样按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013的规定执行.7􀆰2 试样制备按NY/T672和农业部2031号公告—19—2013的规定执行.7􀆰3 试样预处理按农业部1485号公告—4—2010的规定执行.7􀆰4 DNA模板制备按农业部1485号公告—4—2010的规定执行.7􀆰5 PCR扩增7􀆰5􀆰1 普通PCR方法7􀆰5􀆰1􀆰1 试样PCR扩增7􀆰5􀆰1􀆰1􀆰1 每个试样PCR扩增设置3个平行.7􀆰5􀆰1􀆰1􀆰2 按表3依次加入反应试剂,混匀,分装到PCR管中,再加25μL石蜡油(有热盖功能的PCR仪可不加).也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系.表3 普通PCR扩增体系试剂终浓度体积ddH2O—10×PCR缓冲液1×2􀆰5μL25mmol/L氯化镁溶液1􀆰5mmol/L1􀆰5μLdNTPs混合溶液(各2􀆰5mmol/L)0􀆰2mmol/L2􀆰0μL10μmol/L上游引物0􀆰4μmol/L1􀆰0μL10μmol/L下游引物0􀆰4μmol/L1􀆰0μLTaqDNA聚合酶0􀆰025U/μL—25mg/L

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