农业农村部公告第628号-8-2022 转基因植物及其产品成分检测 bar或pat基因定性PCR方法

20221219发布－－20230301－－实施转基因植物及其产品成分检测bar和pat基因定性PCR方法04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020.01BDetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—QualitativePCRmethodofbarandpatgenes中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号—8—2022CCS代替农业部1782号公告—6—2012农业农村部公告第６２８号—８—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件代替农业部１７８２号公告—６—２０１２«转基因植物及其产品成分检测　bar或pat基因定性PCR方法»,与农业部１７８２号公告—６—２０１２相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:———更改了“范围”中关于检测方法的表述(见第１章,２０１２年版的第１章);———更改了“原理”中关于试验方法和结果判断的表述(见第４章,２０１２年版的第４章);———更改了普通PCR引物(见５􀆰１２􀆰１、５􀆰１３􀆰１,２０１２年版的５􀆰１２、５􀆰１３);增加了实时荧光PCR方法引物/探针(见５􀆰１２􀆰２、５􀆰１３􀆰２)、实时荧光PCR试剂盒(见５􀆰２０);———将“仪器”更改为“主要仪器和设备”,增加了实时荧光PCR仪,删除了紫外透射仪、重蒸馏水发生器或纯水仪、其他相关仪器和设备(见第６章,２０１２年版的第６章);———在“分析步骤”中更改了普通PCR扩增体系的配制(见７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰２􀆰２、表１,２０１２年版的７􀆰５􀆰１􀆰２􀆰２、表１),增加了实时荧光PCR方法(见７􀆰５􀆰２);———更改了“结果分析与表述”中普通PCR方法的结果分析与表述(见８􀆰１􀆰２,２０１２年版的８􀆰２),增加了实时荧光PCR方法的结果分析与表述(见８􀆰２);———增加了“检出限”(见第９章);———更改了资料性附录A(见附录A,２０１２年版的附录A).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、吉林省农业科学院、山东省农业科学院、上海交通大学.本文件主要起草人:李飞武、王颢潜、闫伟、张旭冬、李葱葱、龙丽坤、董立明、夏蔚、刘娜、谢彦博、邢珍娟、路兴波、杨立桃.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:———农业部１７８２号公告—６—２０１２.Ⅰ农业农村部公告第６２８号—８—２０２２转基因植物及其产品成分检测bar和pat基因定性PCR方法１　范围本文件规定了转基因植物中bar和pat基因的定性PCR检测方法.本文件适用于转基因植物及其制品中bar和pat基因成分的定性PCR检测.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB/T１９４９５􀆰４—２０１８　转基因产品检测　实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)　检测方法农业部１４８５号公告—４—２０１０　转基因植物及其产品成分检测　DNA提取和纯化农业部２０３１号公告—１９—２０１３　转基因植物及其产品成分检测　抽样NY/T６７２　转基因植物及其产品检测　通用要求SN/T１１９６—２０１２　转基因成分检测　玉米检测方法３　术语和定义下列术语和定义适用于本文件.３􀆰１bar基因　bialaphosresistancegene来源于土壤吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricinacetyltransferase,PAT)的基因.３􀆰２pat基因　phosphinothricinacetyltransferasegene来源于绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes),编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricinacetyltransferase,PAT)的基因.４　原理根据转基因植物中bar和pat基因的核苷酸序列,分别设计普通PCR方法引物、实时荧光PCR方法引物和探针,对试样进行PCR扩增.依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型扩增曲线,判断样品中是否含有bar和pat基因成分.５　试剂和材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂和重蒸馏水.５􀆰１　琼脂糖.５􀆰２　１０g/L溴化乙锭(EB)溶液:称取１􀆰０g溴化乙锭,溶解于１００mL水中,避光保存.警告———溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物.注:根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂.５􀆰３　１０mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液:在１６０mL水中加入８０􀆰０g氢氧化钠,溶解后,冷却至室温,再加水定容到２００mL.１农业农村部公告第６２８号—８—２０２２５􀆰４　５００mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２)溶液(pH８􀆰０):称取１８􀆰６g乙二胺四乙酸二钠,加入７０mL水中,缓慢滴加氢氧化钠溶液(见５􀆰３)直至EDTAＧNa２完全溶解,用氢氧化钠溶液(见５􀆰３)调pH至８􀆰０,加水定容至１００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰５　１mol/L三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸(TrisＧHCl)溶液(pH８􀆰０):称取１２１􀆰１g三羟甲基氨基甲烷溶解于８００mL水中,用盐酸调pH至８􀆰０,加水定容至１０００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰６　TE缓冲液(pH８􀆰０):分别量取１０mL三羟甲基氨基甲烷Ｇ盐酸溶液(见５􀆰５)和２mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见５􀆰４),加水定容至１０００mL.在１０３􀆰４kPa(１２１℃)条件下灭菌２０min.５􀆰７　５０×TAE缓冲液:称取２４２􀆰２g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用５００mL水加热搅拌溶解后,加入１００mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见５􀆰４),用冰乙酸调pH至８􀆰０,然后加水定容到１０００mL.使用时用水稀释成１×TAE.５􀆰８　加样缓冲液:称取２５０􀆰０mg溴酚蓝,加入１０mL水,在室温下溶解１２h;称取２５０􀆰０mg二甲基苯腈蓝,加１０mL水溶解;称取５０􀆰０g蔗糖,加３０mL水溶解.混合以上３种溶液,加水定容至１００mL,在４℃下保存.５􀆰９　DNA分子量标准:可以清楚区分１００bp~１０００bp的DNA片段.５􀆰１０　dNTPs混合溶液:将浓度为１０mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP４种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合.５􀆰１１　TaqDNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及２５mmol/L氯化镁(MgCl２)溶液.５􀆰１２　bar基因引物５􀆰１２􀆰１　普通PCR方法引物:barＧF:５′ＧACAAGCACGGTCAACTTCCＧ３′;barＧR:５′ＧACTCGGCCGTCCAGTCGTAＧ３′.注:预期扩增目的片段大小为１７５bp(参见附录A中的A􀆰１).[来源:SN/T１１９６—２０１２,附录A]５􀆰１２􀆰２　实时荧光PCR方法引物/探针:barＧqF:５′ＧACAAGCACGGTCAACTTCCＧ３′;barＧqR:５′ＧACTCGGCCGTCCAGTCGTAＧ３′;barＧqP:５′ＧCCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGＧ３′.注１:预期扩增目的片段大小为１７５bp(参见A􀆰１).注２:barＧqP为bar基因的TaqMan探针,其５′端标记荧光报告基团(如FAM、HEX等)、３′端标记对应的淬灭基团(如TAMRA、BHQ１等).[来源:GB/T１９４９５􀆰４—２０１８,附录A]５􀆰１３　pat基因引物５􀆰１３􀆰１　普通PCR方法引物:patＧF:５′ＧCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGATＧ３′;patＧR:５′ＧTTCCAGGGCCCAGCGTAAGＧ３′.注:预期扩增目的片段大小为２２７bp(参见A􀆰２).５􀆰１３􀆰２　实时荧光PCR方法引物/探针:patＧqF:５′ＧGTCGACATGTCTCCGGAGAGＧ３′;patＧqR:５′ＧGCAACCAACCAAGGGTATCＧ３′;patＧqP:５′ＧTGGCCGCGGTTTGTGATATCGTTAAＧ３′.注１:预期扩增目的片段大小为１９１bp(参见A􀆰２).注２:patＧqP为pat基因的TaqMan探针,其５′端标记荧光报告基团(如FAM、HEX等)、３′端标记对应的淬灭基团(如TAMRA、BHQ１等).[来源:GB/T１９４９５􀆰４—２０１８,附录A]２农业农村部公告第６２８号—８—２０２２５􀆰１４　内标准基因引物:根据样品种类选择合适的内标准基因,确定对应的检测引物.５􀆰１５　引物/探针溶液:用TE缓冲液(见５􀆰６)或水分别将上述引物或探针稀释到１０μmol/L.５􀆰１６　石蜡油.５􀆰１７　DNA提取试剂盒.５􀆰１８　定性PCR试剂盒.５􀆰１９　PCR产物回收试剂盒.５􀆰２０　实时荧光PCR试剂盒.６　主要仪器和设备６􀆰１　分析天平:感量０􀆰１g和０􀆰１mg.６􀆰２　PCR扩增仪:升降温速度＞１􀆰５℃/s,孔间温度差异＜１􀆰０℃.６􀆰３　实时荧光PCR仪.６􀆰４　电泳槽、电泳仪等电泳装置.６􀆰５　凝胶成像系统或照相系统.７　分析步骤７􀆰１　抽样按NY/T６７２和农业部２０３１号公告—１９—２０１３的规定执行.７􀆰２　试样制样按NY/T６７２和农业部２０３１号公告—１９—２０１３的规定执行.７􀆰３　试样预处理按农业部１４８５号公告—４—２０１０的规定执行.７􀆰４　DNA模板制备按农业部１４８５号公告—４—２０１０的规定执行.７􀆰５　PCR扩增７􀆰５􀆰１　普通PCR方法７􀆰５􀆰１􀆰１　试样PCR扩增７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰１　内标准基因PCR扩增７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰１􀆰１　每个试样PCR扩增设置３个平行.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰１􀆰２　根据选择的内标准基因及其PCR检测方法对试样进行PCR扩增,具体PCR扩增条件参考选择的内标准基因检测方法.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰１􀆰３　扩增结束后取出PCR管,对PCR扩增产物进行电泳检测.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰２　bar和pat基因PCR扩增７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰２􀆰１　每个试样PCR扩增设置３个平行.７􀆰５􀆰１􀆰１􀆰２􀆰２　按表１依次加入反应试剂,混匀,分装到PCR管中,再加２５μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加);也可采用经验证的、效果相当的定性PCR试剂盒配制反应体系.表１　普通PCR扩增体系试剂终浓度体积ddH２O—１０×PCR缓冲液１×２􀆰５μL２５mmol/L氯化镁溶液１􀆰５mmol/L１􀆰５μLdNTPs混合溶液(各２􀆰５mmol/L)０􀆰２mmol/L２􀆰０μL３农业农村部公告第６２８号—８—２０２２表１(续)试剂终浓度体积１０μmol/L上游引物０􀆰２μmol/L０􀆰５μL１０μmol/L下游引物０􀆰２μmol/L０􀆰５μLTaqDNA聚合酶０􀆰０５U/μL—２５mg/LDNA模板２mg/L２􀆰０μL总体积２５􀆰０μL　　“—”表示体积不确定,如果PCR缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,根据Taq酶的浓度确定其体积,并相应调整ddH２O的体积,使反应体系总体积达到２５􀆰０μL.在bar基因PCR扩增体系中,上、下游引物分别为barＧF和barＧR;在pat基因PCR扩增体系中,上、下游引物分别为p