农业农村部公告第628号-7-2022 转基因植物及其产品成分检测 抗虫转Bt基因棉花外源Bt蛋白表

20221219发布－－20230301－－实施转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源Bt蛋白表达量ELISA检测方法04中华人民共和国国家标准备案号：XXXX-XXXXＩＣＳ65.020.01BDetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—ELISAmethodforquantitativedetectionofexogenousBtproteininBttransgeniccotton中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第628号—7—2022CCS代替农业部1943号公告—4—2013农业农村部公告第６２８号—７—２０２２前　　言本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定起草.本文件代替农业部１９４３号公告—４—２０１３«转基因植物及其产品成分检测　抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范».与农业部１９４３号公告—４—２０１３相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:———修改了“标题”(见标题,２０１３年版的标题);———修改了“前言”(见前言,２０１３年版的前言);———修改了“范围”(见第１章,２０１３年版的第１章);———修改了“原理”(见第４章,２０１３年版的第３章);———修改了“仪器和设备”,增加了超低温冷冻研磨仪(见第５章,２０１３年版的第４章);———修改了“田间种植与管理”(见６􀆰２,２０１３年版的５􀆰２);———修改了“取样”中的铃期取样部位(见第７章,２０１３年版的第６章);———修改了“试样和试液制备”,增加了超低温冷冻研磨设备研磨方法(见８􀆰２,２０１３年版的７􀆰２);———修改了“检测”(见８􀆰３,２０１３年版的７􀆰３);———修改了“标准回归方程建立”(见８􀆰４,２０１３年版的７􀆰４);———修改了“结果计算”(见８􀆰５,２０１３年版的７􀆰５);———修改了“结果分析与表述”(见第９章,２０１３年版的第８章).请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.本文件由中华人民共和国农业农村部提出.本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.本文件起草单位:农业农村部科技发展中心、中国农业科学院油料作物研究所、中国农业科学院棉花研究所、安阳工学院.本文件主要起草人:曾新华、王颢潜、张元臣、吴刚、梁晋刚、崔金杰、雒珺瑜、闫晓红、罗军玲、刘芳、朱莉、李晓飞、袁荣、王淼.本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:———农业部１４８５号公告—１４—２０１０;———农业部１９４３号公告—４—２０１３.Ⅰ农业农村部公告第６２８号—７—２０２２转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因棉花外源Bt蛋白表达量ELISA检测方法１　范围本文件规定了田间种植的抗虫转Bt基因棉花不同生育期组织和器官中外源Bt蛋白表达的ELISA定量检测方法.本文件适用于田间种植的抗虫转Bt基因棉花不同生育期组织和器官中外源Bt蛋白表达的ELISA定量检测.２　规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.GB４４０７􀆰１　经济作物种子　第１部分:纤维类３　术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.４　原理在适宜生态区田间种植受试转基因棉花品种(系)、阴性对照棉花品种(系)和阳性对照棉花品种,分别抽取苗期、蕾期、铃期等关键生育期的棉花叶片、蕾、铃,采用酶联免疫方法(ELISA)检测外源Bt蛋白的表达量,比较受试转基因棉花品种(系)与阳性对照棉花品种(系)外源Bt蛋白表达水平.５　仪器和设备５􀆰１　分析天平:感量０􀆰００１g.５􀆰２　酶标仪.５􀆰３　超低温冰箱.５􀆰４　超低温冷冻研磨仪.５􀆰５　其他相关仪器和设备.６　试验方法６􀆰１　试验材料６􀆰１􀆰１　受试转基因棉花品种(系).６􀆰１􀆰２　阴性对照品种(系):非转Bt基因棉花对照品种(系).６􀆰１􀆰３　阳性对照品种:转Bt基因抗虫棉花对照品种.６􀆰１􀆰４　种子应符合GB４４０７􀆰１的质量要求.６􀆰２　田间种植与管理随机区组设计,３次重复,小区面积不小于３０m２.按当地春棉或夏棉(短季棉)常规播种时期、播种方式和播种量进行播种,按当地常规田间管理方式进行管理.６􀆰３　资料记录６􀆰３􀆰１　试验地名称与位置１农业农村部公告第６２８号—７—２０２２记录试验所在地的名称、试验的具体地点、经纬度.绘制小区播种示意图.６􀆰３􀆰２　气象资料记录试验期间试验地降水(降水类型、日降水量,以mm表示)和温度(日平均温度、最高和最低温度、积温,以℃表示)的资料.记录影响整个试验期间试验结果的恶劣气候因素,例如严重或长期的干旱、暴雨、冰雹等.７　取样在棉花苗期(４片~６片真叶)、蕾期(盛蕾期)和铃期(结铃盛期),分别从受试转基因棉花品种(系)、阴性对照品种(系)和阳性对照品种采集棉花样品,每小区随机选择２０株生长正常的棉花植株进行样品采集.苗期,每株取顶部第一片完全展开叶;蕾期,每株取顶部第一片完全展开叶和１个小蕾(直径０􀆰５cm~０􀆰７cm);铃期,每株取上部侧枝顶部第一片完全展开叶和１个小铃(直径０􀆰５cm~１􀆰０cm).将每个小区采集的同一时期、同一组织器官的样品作为一个样本,密封包装后做好标记,迅速带回实验室检测或用液氮速冻后,放入－８０℃超低温冰箱中保存并尽快检测.８　外源Bt蛋白表达量检测８􀆰１　试剂盒的选择根据待检目标蛋白的类型,选用经验证适用于棉花外源Bt蛋白检测的ELISA试剂盒,试剂盒的定量限(Limitofquantification,LOQ)应不大于０􀆰１ng.８􀆰２　试样制备将每个小区采集的同一时期、同一组织器官的试样作为一个样本,加液氮人工研磨至均匀的粉末.也可利用超低温研磨仪在超低温条件下将样本研磨至均匀的粉末.称取不少于０􀆰１g(精确至０􀆰００１g)研磨后的试样粉末于适宜大小的离心管,按质量体积比１∶１０加入提取缓冲液(按照试剂盒所述进行配制),充分混匀后置于４℃下振荡１２h.４℃,８０００g离心２０min,吸取上清液移入另一干净的离心管,待测.每个样本至少３次重复.上清液可在２℃~８℃储存,时间不超过２４h.８􀆰３　检测按照ELISA试剂盒操作说明书,检测试样上清液中外源Bt蛋白含量,得到相应的光密度值(Opticaldensity,OD).８􀆰４　标准回归方程建立将标准蛋白稀释成６个浓度梯度,与受试转基因棉花品种(系)品种、阴性对照品种(系)样品和阳性对照品种样品的提取上清液(根据含量进行必要的稀释,稀释倍数为n)和空白对照一起加入酶标板内相应位置,每个样品设置２个平行重复,按照８􀆰３步骤进行检测,得到相应的光密度值(X).阴性对照样品光密度值应小于标准蛋白稀释液最低浓度的光密度值,否则重新检测.根据标准蛋白浓度与光密度值的相关性建立标准回归方程Y＝a＋b×X,回归方程的相关系数R２应大于或等于０􀆰９８,否则重新检测.８􀆰５　结果计算按公式(１)计算蛋白含量.ω＝(a＋b×X)×n×Vm(１)􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺式中:ω———蛋白浓度的数值,单位为纳克每克鲜重(ng/g鲜重);a———截距;b———斜率;X———光密度值;２农业农村部公告第６２８号—７—２０２２n———稀释倍数;V———试样提取时加入的提取缓冲液体积的数值,单位为毫升(mL);m———试样质量的数值,单位为克(g).注:计算结果保留小数点后２位数字.采取统计学方法计算３个小区样本外源Bt蛋白含量平均值(􀭵ω)和标准差(S).外源Bt蛋白量值表述为(􀭵ω±S)ng/g.９　结果分析与表述根据计算得到的受试转基因棉花品种(系)和阳性对照品种(××时期、××组织器官)中外源Bt蛋白的含量,用方差分析的方法比较受试转基因棉花品种(系)与阳性对照(××时期、××组织器官)中外源Bt蛋白的含量差异.结果表述为:受试转基因棉花品种(系)(××时期、××组织器官)中外源Bt蛋白含量为××ng/g,高(低)于阳性对照品种,差异(未)达到(极)显著水平.３