农业农村部公告 第284号 孟布酮残留检测方法标准(试行) 动物性食品中孟布酮残留量的测定 高效液相

附件4孟布酮每日允许摄入量和最高残留限量（试行）申报单位参照欧盟有关标准制定孟布酮每日允许摄入量（ADI），参照日本肯定列表制定最高残留限量（MRLs），如下表：活性成分ADI残留标示物动物品种靶组织MRLs孟布酮0-60μg·（kg·b.w.·d）-1孟布酮猪肌肉40μg·kg-1脂肪40μg·kg-1肝脏40μg·kg-1肾脏40μg·kg-1附件5孟布酮残留检测方法标准（试行）动物性食品中孟布酮残留量的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了动物性食品中孟布酮残留检测的制样和高效液相色谱测定方法。本标准适用于猪肌肉、脂肪、肝脏和肾脏组织中孟布酮残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验条件。3原理试料中残留的孟布酮，用乙腈或脂肪提取溶剂（乙腈︰乙酸乙酯︰水=90︰4︰6）提取，冷冻除脂后，经反相固相萃取柱净化，用反相高效液相色谱-紫外检测器检测，外标法定量。4试剂和材料以下所用试剂，除特别注明外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1孟布酮对照品：纯度≥99.0%。4.2乙腈、乙酸乙酯、甲醇：色谱纯。4.3磷酸：含量≥85%。4.40.5%磷酸溶液：取磷酸5mL，加水稀释至1000mL，混匀，即得。4.5流动相：乙腈-0.5%磷酸溶液（36︰64），滤过，超声30min，即得。4.6孟布酮储备液（1mg/mL）：精密称取孟布酮对照品10mg于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。保存于-20℃，有效期为3个月。4.7孟布酮标准工作液：精密量取孟布酮储备液，用流动相稀释成浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的系列标准工作液。4.8浓氨溶液：色谱纯，含量≥25%。4.90.5%氨水溶液：取浓氨溶液0.5mL，加水至100mL，混匀即可。4.109%氨化甲醇溶液：取浓氨溶液9mL，加甲醇至100mL，混匀即可。4.11脂肪提取溶剂：乙腈-乙酸乙酯-水（90︰4︰6）。4.12微孔滤膜：有机相，孔径0.22μm。4.13反相固相萃取柱：如OasisWAX60mg/3mL，30μm或效能相当的萃取柱。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪（配紫外检测器）。5.2天平：感量0.01g。5.3分析天平：感量0.00001g。5.4研磨杯。5.5高速冷冻离心机。5.6多管涡旋混合器。5.7固相萃取装置。5.8氮吹仪。6试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎并使均质。──取均质后的供试样品，作为供试试料。──取均质后的空白样品，作为空白试料。──取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20℃以下保存。7测定步骤7.1提取准确称取猪肌肉、肝脏、肾脏组织（1.00±0.01）g，加乙腈2mL，涡旋10min，8000r/min，4℃离心10min，取上清液。重复提取1次。合并2次提取的上清液，置于-70℃冰箱6min，12000r/min，4℃离心10min，取上清液，40℃氮气吹干，残留物中加入0.5%氨水溶液3mL，涡旋5min，得到复溶液，备用。准确称取猪脂肪组织（1.00±0.01）g，加脂肪提取溶剂2mL，涡旋25min，直至呈均匀的乳浊状，8000r/min，4℃离心10min，取上清液。重复提取1次。合并2次提取的上清液，置于-70℃冰箱6min，12000r/min，4℃离心10min，取上清液，40℃氮气吹干，残留物中加入0.5%氨水溶液3mL，涡旋5min，得到复溶液，备用。7.2净化将反相固相萃取柱依次用甲醇3mL、水3mL进行活化；复溶液3mL上样；用甲醇3mL淋洗，抽干；9%氨化甲醇溶液3mL洗脱，抽干。收集洗脱液，40℃氮气吹干，加入流动相300μL复溶，涡旋5min，滤过，滤液供高效液相色谱仪测定。7.3标准曲线制备分别精密量取孟布酮标准工作液适量，使孟布酮质量分别为30ng、40ng、80ng、200ng、500ng和1000ng，40℃氮气吹干，分别用流动相300μL复溶，得6个不同浓度的孟布酮标准溶液（即100μg/L、133.3μg/L、266.6μg/L、666.6μg/L、1666.6μg/L和3333.3μg/L，相当于供试试料中含孟布酮30µg/kg、40µg/kg、80µg/kg、200µg/kg、500µg/kg和1000µg/kg），以峰面积为纵坐标、相应浓度为横坐标绘制标准曲线。7.4色谱条件色谱柱：WatersXbridgeBEHC18柱（4.6mm250mm，5μm）或效能相当的色谱柱。流动相：乙腈-0.5%磷酸溶液（36︰64）。检测波长：235nm。流速：1.0mL/min。进样量：50μL。柱温：25℃。7.5测定方法按照标准曲线校正法或单点校正法测定试料中孟布酮残留量。标准工作液及试料溶液中孟布酮的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，孟布酮标准工作液和空白添加试料溶液的高效液相色谱图见附录图A1～图A9。7.6空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算和表述试料中孟布酮残留量的计算公式：单点校正：X=A×Cs×V×1000/（As×m）或标准曲线校正：X=C×V×1000/m式中：X——试样中孟布酮的残留量，μg/kg；A——试样溶液中孟布酮的峰面积；Cs——标准工作液中孟布酮的浓度，μg/mL；V——流动相复溶残留物的体积，mL；As——标准工作液中孟布酮的峰面积；m——-称样量，g；C——由标准曲线获得的孟布酮浓度，μg/mL。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9方法灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法的检测限为20μg/kg，定量限为30μg/kg。9.2准确度本方法在30µg/kg～800µg/kg添加浓度的回收率为75%～120%。9.3精密度本方法的批内、批间相对标准偏差均≤15%。附录A（资料性附录）图A1孟布酮对照品溶液色谱图（30μg/L）图A2猪肌肉空白试料色谱图图A3猪肌肉空白添加试料色谱图（30μg/kg）图A4猪脂肪空白试料色谱图图A5猪脂肪空白添加试料色谱图（30μg/kg）图A6猪肝脏空白试料色谱图图A7猪肝脏空白添加试料色谱图（30μg/kg）图A8猪肾脏空白试料色谱图图A9猪肾脏空白添加试料色谱图（30μg/kg）