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附件4恩诺沙星残留检测方法标准（试行）牛可食性组织中恩诺沙星残留量检测液相色谱-串联质谱法（试行）1范围本标准规定了牛可食性组织中恩诺沙星和环丙沙星残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于牛的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中恩诺沙星和环丙沙星残留量的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试料中残留的恩诺沙星、环丙沙星经提取液提取，离心后取上清液，以正己烷净化，弃正己烷层，下层溶液氮气流吹干后复溶，离心，上清液以液相色谱-串联质谱仪测定恩诺沙星、环丙沙星残留量，内标法定量。4试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1对照品：恩诺沙星，含量≥95%；盐酸环丙沙星，含量≥95%；盐酸恩诺沙星-d5，含量均≥95%；盐酸环丙沙星-d8，含量≥90%。4.2乙腈：分析纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4甲醇：分析纯。4.5甲醇：色谱纯。4.6甲酸：分析纯。4.7甲酸：色谱纯。4.8正己烷。4.91%甲酸乙腈溶液：准确量取甲酸1mL，置100mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，充分混匀。4.101%甲酸乙腈溶液-甲醇（95:5,V/V）溶液：准确量取甲醇5mL，置100mL容量瓶中，用1%甲酸乙腈溶液稀释至刻度，混匀。4.110.1%甲酸溶液：准确量取甲酸（色谱纯）1.00mL，置1L容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，混匀。4.120.1%甲酸溶液-乙腈（95:5,V/V）：准确量取乙腈（色谱纯）5mL，置100mL容量瓶中，加入0.1%甲酸溶液稀释至刻度，混匀。4.13乙腈饱和的正己烷：取一定量的正己烷加入适量乙腈，直至充分混匀静置后有分层为止。4.14标准储备液：根据各对照品的含量，精密称取各对照品适量，恩诺沙星、环丙沙星配制成浓度为200µg/mL的储备液，恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8配制成浓度为100µg/mL的储备液。将精密称取的单个对照品分别置于10mL棕色容量瓶中，加入甲醇（色谱纯）约5mL，涡旋、超声使溶解，再用甲醇（色谱纯）稀释并定容至10mL。-20℃保存，有效期3个月。使用时将标准储备液按需要用甲醇（色谱纯）逐级稀释为标准工作溶液（10µg/mL、1µg/mL或100ng/mL），现配现用。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2天平：感量0.01g。5.3分析天平：感量0.00001g。5.4移液器：容量20～200µL，100～1000µL。5.5高速组织捣碎机。5.6高速冷冻离心机。5.7涡旋混合器。5.8摇床。5.9超声波清洗器。5.10氮气吹干仪。5.11有机滤膜：0.22µm。6试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的样品去筋，经高速组织捣碎机均匀捣碎，作为试料。试料的制备包括：——取匀质的供试样品，作为供试试料。——取匀质的空白样品，作为空白试料。——取匀质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20±5℃贮存备用。7测定步骤7.1样品前处理准确称取试样2±0.02g，加入相应体积的混合内标工作液，使内标（恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8）的添加浓度均为50ng/g，涡旋混匀，避光静置30min。加入1%甲酸乙腈-甲醇（95:5,V/V）溶液5mL涡旋混匀，放入超声波清洗器中水浴超声15min，300mot/min，水平振荡20min，于4℃以8000r/min离心10min。将上清液转移至15mL聚丙烯离心管中，样品残渣用1%甲酸乙腈-甲醇（95:5,V/V）溶液4mL按以上方法重复提取一次，合并两次上清液于15mL离心管中。再用1%甲酸乙腈溶液-甲醇（95:5,V/V）溶液将其定容至10mL，涡旋约30s，300mot/min，水平振荡10min使充分混合均匀，于4℃以8000r/min离心10min。将上清液移至另一15mL离心管中。准确移取最终得到的上清液2mL于玻璃试管中，加入乙腈饱和的正己烷3mL涡旋约1min，静置至分层，弃去上层的正己烷层，再加入乙腈饱和的正己烷3mL重复除脂肪一次。将剩余溶液置于45℃恒温水浴锅中，氮气吹干。向吹干后的试管中加入0.1%甲酸溶液-乙腈（95:5,V/V）溶液1mL，涡旋超声5min，再涡旋充分溶解残渣。然后将其移至2mLEP管中，于4℃以15000r/min离心15min。上清液过0.22µm有机滤膜，供液相色谱-串联质谱仪检测。7.2标准工作曲线制作用各空白样品按照前处理方法处理后得到的空白基质液将恩诺沙星、环丙沙星标准溶液均稀释成浓度为1、2、5、10、20、40、80、160ng/mL的系列基质匹配标准工作液，内标（恩诺沙星-d5、环丙沙星-d8）的浓度均为20ng/ml。供液相色谱-串联质谱法测定。以测得的恩诺沙星、环丙沙星及内标的特征离子质量色谱峰面积之比为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。7.3测定7.3.1液相色谱参考条件色谱柱：LunaC18(2)（150mm×2.0mmi.d.,5µm）或其他等效色谱柱。流速：250µL/min。柱温：35℃。进样量：5µL。流动相：流动相A（0.1%甲酸溶液）和流动相B（乙腈），采用梯度洗脱，线性梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序时间（min）A%B%095539558752512307014955169557.3.2质谱参考条件离子源：电喷雾离子源。扫描方式：正离子扫描。检测方式：多反应监测。电离电压：3500V。源温：300℃。雾化温度：250℃。锥孔气流速：360L/h。雾化气流速：660L/h。恩诺沙星、环丙沙星和内标的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表2。表2恩诺沙星、环丙沙星和内标的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量药物定性离子对（m/z）锥孔电压（V）碰撞能量（eV）恩诺沙星360.2316.2a13012360.2342.216恩诺沙星-d5365.2288.113040环丙沙星332.2288.3a13012332.2314.212环丙沙星-d8340.2322.113020（a定量离子）7.3.3样品测定取试样溶液和相应的基质匹配标准溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。对照溶液及试样溶液中恩诺沙星、环丙沙星和内标的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样溶液中的离子相对丰度与标准溶液的离子相对丰度比符合表3的要求。标准溶液和空白组织及空白组织添加试样溶液的各特征离子的质量色谱图见附录A。表3试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对离子丰度50%20%至50%10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%7.4空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算与表述单点校准：issisissisCAACCAA''C………………………………（1）或标准曲线校准：由bCCaAAiss''iss求得a和b，则)(CbAAaCisis………………………………（2）试料中药物残留量按式（3）计算：m5CVX………………………………（3）式中：C——试样溶液中药物的浓度，ng/mL；A——试样溶液中药物的峰面积；A’is——对照溶液中药物内标的峰面积；Cs——对照溶液中药物的浓度，ng/mL；Cis——试样溶液中药物内标的浓度，ng/mL；Ais——试样溶液中药物内标的峰面积；As——对照溶液中药物的峰面积；C’is——对照溶液中药物内标的浓度，ng/mL；X——供试试料中药物的残留量，µg/kg；V——溶解残余物的体积，mL；m——供试试料质量，g。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9检测方法线性、灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法在牛肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中的定量限为10µg/kg。9.2准确度本方法在牛肌肉组织中恩诺沙星和环丙沙星在10～200µg/kg添加浓度范围内，牛肝脏组织中恩诺沙星和环丙沙星在10～600µg/kg添加浓度范围内，牛肾脏组织中恩诺沙星和环丙沙星在10～400µg/kg添加浓度范围内和牛脂肪组织中恩诺沙星和环丙沙星在10～200µg/kg添加浓度范围内时，回收率范围均为60%～110%。9.3精密度本方法在批内相对标准偏差小于15%，本方法在批间相对标准偏差小于20%。附录A（资料性附录）特征离子质量色谱图图A.1恩诺沙星及恩诺沙星-d5对照溶液特征离子质量色谱图图A.2环丙沙星及环丙沙星-d8对照溶液特征离子质量色谱图图A.3空白牛肝脏组织溶液中特征离子质量色谱图-恩诺沙星图A.4空白牛肝脏组织溶液中特征离子质量色谱图-环丙沙星图A.5牛肝脏基质添加恩诺沙星及内标特征离子质量色谱图（上图恩诺沙星-d5：20μg/L；下图恩诺沙星：1μg/L）图A.6牛肝脏基质添加环丙沙星及内标特征离子质量色谱图（上图环丙沙星-d8：20μg/L；下图环丙沙星：1μg/L）