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ⅡICS11.220B41团体标准T/CVMA4—2018猫泛白细胞减少症诊断技术规范Diagnostictechnicalspecificationforfelinepanleukopenia2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布中国兽医协会CVMAT/CVMA4—2018I目次前言..................................................................................II1范围................................................................................12术语和定义、缩略语..................................................................13诊断依据............................................................................14诊断原则............................................................................35诊断标准............................................................................3附录A（规范性附录）猫泛白细胞减少症病毒分离培养和鉴定方法..........................4附录B（规范性附录）红细胞凝集试验和凝集抑制试验....................................6附录C（资料性附录）猫泛白细胞减少症游离抗原检测法..................................8附录D（资料性附录）猫泛白细胞减少症核酸检测法.....................................10附录E（资料性附录）猫泛白细胞减少症病原学、流行病学和临床表现特点.................12中国兽医协会CVMAT/CVMA4—2018II前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由瑞派宠物医院管理股份有限公司提出。本标准由中国兽医协会归口。本标准主要起草单位：瑞派宠物医院管理股份有限公司。本标准主要起草人：周同改。中国兽医协会CVMAT/CVMA4—20181猫泛白细胞减少症诊断技术规范1范围本标准规定了猫泛白细胞减少症的诊断依据、诊断原则和诊断判定。本标准适用于宠物诊疗机构及其兽医工作人员对猫泛白细胞减少症的诊断、报告。2术语和定义、缩略语下列术语和定义、缩略语适用于本文件。2.1猫泛白细胞减少症felinepanleukopenia又称猫瘟热（felinedistemper）或猫的细小病毒病（parvovirosisincats），是由细小病毒感染引起的猫特别是幼龄猫的一种发热性、高度接触性、致死性传染病，病原包括猫细小病毒和犬细小病毒。2.2FPLVFelinepanleukopeniavirus，猫泛白细胞减少症病毒2.3FPVFelineparvovirus，猫细小病毒2.4CPVCanineparvovirus，犬细小病毒2.5CPV–2Canineparvovirustype2，犬细小病毒2型2.6CPV–2aCanineparvovirustype2a，犬细小病毒2a型2.7CPV–2b中国兽医协会CVMAT/CVMA4—20182Canineparvovirustype2b，犬细小病毒2b型2.8CPV–2cCanineparvovirustype2c，犬细小病毒2c型2.9F81FelinekidneycelllineF81，猫肾细胞系2.10HAHemagglutinationtest，血凝试验2.11HIHemagglutinationinhibitiontest，血凝抑制试验2.12ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附试验2.13PCRPolymerasechainreaction，聚合酶链反应3诊断依据3.1流行病学史未免疫、免疫不全、免疫失败或者免疫抑制的猫，尤其幼猫和群居猫易感。病患及隐性携带者可经体液、粪便及污染物直接感染猫，也可通过用具、垫料及人、跳蚤、苍蝇等作为媒介传播病原。3.2临床表现3.2.1本病临床症状严重程度视个体差异较大，从无症状感染到轻度发热再到严重的急性特征，甚至12小时之内的猝死。发热、呕吐、腹泻是急性感染的三个典型症状。——发热：急性病例早期表现发热，在潜伏期2d～7d后出现，直肠温度高达40℃以上，精神沉郁，厌食，活力下降。——呕吐：经常在发热开始后1d～2d出现呕吐。即便未进食也可能出现呕吐，属典型的胆汁型呕吐。——腹泻：腹泻可能略有延迟，也不是一直出现。腹泻严重时呈水样或血便。3.2.2随着病程的进一步加重，出现脱水、消瘦、胃肠道积液积气、腹部触诊疼痛等。中国兽医协会CVMAT/CVMA4—201833.2.3子宫感染早期会出现死胎、流产或重吸收；怀孕晚期或新生仔猫感染引起“猫共济失调综合征”，出现辨距不良、四肢外展和震颤摇摆。3.3病理变化3.3.1小肠水肿增厚、充血、出血，严重的呈伪膜性炎症变化，肠上皮细胞脱落，肠绒毛萎缩，小肠后段有灰红或黄绿色纤维素性坏死性假膜或条索，内容物灰黄色、水样、恶臭。3.3.2肠系膜淋巴结肿大、充血、出血，呈红白灰相间的大理石样花纹。3.3.3感染胚胎或新生仔猫小脑发育不全。3.3.4多数病例的长骨骨髓变为液体或半液体。3.3.5病程在3d～4d以内的患猫，其肠管上皮细胞可见嗜酸性和嗜碱性两种包涵体。3.4外周血象白细胞计数明显减少，通常会在2000个/µL～4000个/µL以下，其中嗜中性粒细胞减少症和淋巴细胞减少症多发，也会出现贫血和血小板减少症。3.5实验室检测3.5.1猫泛白细胞减少症病毒分离培养并鉴定为阳性，具体操作参见附录A。3.5.2血凝试验阳性，并被已知猫泛白细胞减少症病毒免疫血清抑制血凝，操作参见附录B。3.5.3粪便中猫泛白细胞减少症病毒游离抗原检测阳性，操作参见附录C。3.5.4猫泛白细胞减少症病毒核酸检测阳性，操作参见附录D。4诊断原则猫泛白细胞减少症病例的诊断是以病原学检查为主，结合流行病学史、临床表现、病理变化和外周血象等进行综合分析做出诊断。流行病学史和临床表现是该病诊断的重要依据，但不是必要条件，病理变化和外周血象也只是辅助诊断依据。病例确诊需严格的病原学检测证据。5诊断判定5.1猫泛白细胞减少症疑似病例具备3.2与3.3中的任何一项或3.1、3.4者，且无其它明确诊断的胃肠炎、幼猫神经症状或成猫流产的病例。5.2猫泛白细胞减少症确诊病例具备3.5中任何一项的猫泛白细胞减少症疑似病例。5.3猫泛白细胞减少症排除病例同时具备以下两项的，可排除猫泛白细胞减少症：——患猫粪便泛白细胞减少症病毒游离抗原检测阴性（3.5.3），且病毒分离阴性（3.5.1）或病毒核酸检测阴性（3.5.4），并经至少两个公司检测试剂或实验室所证实。——死亡患猫无法进行血象检测，尸检组织病毒分离阴性（3.5.1）或病毒抗原（3.5.3）及核酸检测阴性者（3.5.4），并经至少两个公司检测试剂或实验室所证实。中国兽医协会CVMAT/CVMA4—20184附录A（规范性附录）猫泛白细胞减少症病毒分离培养和鉴定方法A.1猫泛白细胞减少症病毒的分离培养A.1.1实验材料F81细胞、肉汤培养基、MEM粉、青霉素、链霉素、胎牛血清、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、NaOH、2%磷钨酸。A.1.2培养基和试剂的准备A.1.2.1肉汤培养基将蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH至7.2～7.4，分装，121℃高压灭菌20min备用。A.1.2.20.01mol/LPBS将Na2HPO4·12H2O3.582g，KH2PO40.272g，NaCl8.0g，KCl0.2g加入到900mL去离子水中，磁力搅拌器进行加热溶解，用1mol/LNaOH调节pH至7.2，补加去离子水至1000mL，高压灭菌后置于4℃保存。A.1.2.3双抗溶液（青霉素：10000U/mL，链霉素：10mg/mL）将160万单位青霉素粉溶于80mL的五蒸水中，同时将1g链霉素粉溶于50mL的五蒸水中，充分溶解后各取50mL进行混合，混匀后经0.22μm滤器过滤除菌、分装，-20℃冻存备用。A.1.2.4MEM营养液将9.6gMEM粉和1.1gNaHCO3溶于800mL五蒸水中，用1mol/LNaOH调节pH至7.2～7.4，加水定容至1L，经0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存。细胞生长液：按8%的比例在MEM营养液中加入胎牛血清。细胞维持液：按2%的比例在MEM营养液中加入胎牛血清。A.1.3方法A.1.3.1病料采集及处理采集活猫的粪便或病死猫的肝、脾、肺、心和肠等病料，分别加灭菌的PBS液（0.01mol/LPBS）匀浆研磨制成悬液，首先3500r/min离心20min，之后7000r/min离心10min。吸取上清液，按20%的比例加入双抗溶液，4℃过夜。A.1.3.2细胞培养和增毒A.1.3.2.1单层猫肾细胞的准备用含8%胎牛血清的MEM生长液培养F81细胞，待长满单层，移弃生长液。中国兽医协会CVMAT/CVMA4—20185A.1.3.2.2细胞接种接种A.1.3.1中混合双抗的病料上清液0.3mL，37℃吸附2h，随后弃去上清液，加入含2%血清的MEM细胞维持液，37℃5%CO2条件下静置培养，同时设正常细胞对照。每天注意观察细胞生长和细胞病变情况。A.1.3.2.3细胞培养物的收获若细胞在接种后3d～4d内仍未出现病变则进行盲传，若盲传至第4代仍未出现有细胞病变的视为阴性，出现病变的细胞反复冻融3次后收毒，之后置于-20℃保存。A.2病毒鉴定A.2.1电镜形态学鉴定A.2.1.1方法用分离病毒的第5代F81细胞培养上清单层接种F81细胞2瓶，37℃静置培养待出现典型细胞病变后，将其中1瓶经-20℃/37℃反复冻融3次，收毒后5000r/min离心10min，取上清液以磷钨酸负染做电镜观察；另一瓶待80%细胞出现典型CPE时，弃去细胞培养液，刮取CPE细胞，离心后以2.5%戊二醛与1%锇酸双固定，用环氧树脂包埋、超薄切片、染色，进行电镜超微结构观察。A.2.1.2结果用F81培养物上清做电镜负染观察，可见病毒呈立体对称、直径22nm左右的病毒粒子。在病变细胞超薄切片中，细胞核内可见有病毒包涵体，成熟的病毒颗粒从核孔向细胞质中释放，病毒颗粒与细小病毒的形态和大小相符。A.2.2红细胞凝集试验（HA）和凝集抑制试验（HI）具体操作见附录B。中国兽医协会CVMAT/CVMA4—20186附录B（规范性附录）红细胞凝集试验和凝集抑制试验B.1实验材料FK81细胞（猫肾细胞），0.9%生理盐水，1%猪红细胞液，FPLV免疫血清，96孔“V”形微量反应板，50µL定量移液管，滴头，稀释棒，振荡器，恒温培养箱。B.2试剂配制B.2.1Alsever红细胞保养液枸橼酸钠0.8g，枸橼酸0.055g，氯化钠0.42g，葡萄糖2.05g，双蒸水100mL，将以上试剂加热溶解，用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调整pH至6.1±0.1，用0.22μm的细菌滤器过滤。B.2.21%猪红细胞液取Alsever红细胞保养液中的猪红细胞液，加等体积灭菌生理盐水，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加等体积灭菌生理盐水悬浮红细胞离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次。取1mL红细胞加99mL灭菌生理盐水配成1%猪红细胞液。B.3红细胞凝集试验（HA）步骤B.3.1样品采集活猫的粪便，