农业农村部公告 第283号 莫能菌素残留检测方法标准(试行)

附件4莫能菌素残留检测方法标准（试行）鸡和牛可食性组织中莫能菌素残留量的测定液相色谱-串联质谱法（试行）1.范围本标准规定了鸡和牛可食性组织中莫能菌素残留量检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏、皮+脂，牛的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中莫能菌素残留量的检测。2.规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3.原理试料中的莫能菌素用异辛烷-乙酸乙酯混合液提取，硅胶固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。4.试剂和材料以下所用的试剂，除特别注明外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1莫能菌素、尼日利亚菌素标准品：纯度≥95%。4.2乙腈：色谱纯。4.3甲醇：色谱纯。4.4正己烷：色谱纯。4.5乙酸乙酯：色谱纯。4.6异辛烷：色谱纯。4.7甲酸：色谱纯。4.8碳酸氢钠。4.9无水硫酸钠。4.10中性甲醇：取1000mL甲醇，加入1gNaHCO3，充分混合，静置后取上清液使用，如果浑浊则用11µm滤纸过滤后使用。4.11提取溶剂：取4500mL异辛烷，加入500mL乙酸乙酯，混匀。4.12硅胶固相萃取柱淋洗溶剂：取500mL乙酸乙酯，加入500mL正己烷，混匀。4.13硅胶固相萃取柱洗脱溶剂：取800mL乙酸乙酯，加入200mL甲醇，混匀。4.140.1%甲酸水溶液：取1000mL超纯水，加入1mL甲酸，混匀，必要时过滤。4.150.1%甲酸乙腈溶液：取5000mL乙腈，加入5mL甲酸，混匀，必要时过滤。4.16莫能菌素标准储备液（1mg/mL）：准确称取含10mg莫能菌素的标准品，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为1mg/mL的标准储备液。-20℃保存，有效期3个月。4.17莫能菌素中间标准工作液（10µg/mL）：准确移取适量莫能菌素标准储备液（1mg/mL），用中性甲醇稀释，配制成浓度为10µg/mL的中间标准工作液。2～8℃保存，有效期1个月。4.18尼日利亚菌素内标储备液（0.5mg/mL）：准确称取含5mg尼日利亚菌素标准品，于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度约为0.5mg/mL的标准储备液。-20℃保存，有效期3个月。4.19尼日利亚菌素添加内标工作液（2.5µg/mL）：准确移取适量内标储备液（0.5mg/mL），用乙酸乙酯稀释，配制成浓度为2.5µg/mL的添加内标工作液。2～8℃保存，有效期1个月。4.20尼日利亚菌素校准内标工作液（2.5µg/mL）：准确移取适量内标储备液（0.5mg/mL），用中性甲醇稀释，配制成浓度为2.5µg/mL的校准内标工作液。2～8℃保存，有效期1个月。5.仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI源）。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4组织匀浆机。5.5高速冷冻离心机。5.6涡旋混合器。5.7振荡器。5.8氮吹仪。5.9固相萃取装置。5.10水浴超声波。5.11硅胶固相萃取柱：500mg-6mL或相当者。5.12钢珠：10mm。6.试料的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。——取均质的供试样品，作为供试试料。——取均质的空白样品，作为空白试料。——取均质的空白样品，添加由乙酸乙酯稀释的适宜浓度莫能菌素标准溶液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20℃以下保存。7.测定步骤7.1提取称取试料5(±0.05)g，置于50mL离心管中，加入200µL尼日利亚菌素添加内标工作液(2.5µg/mL)，涡旋混合后静置30min。7.1.1肝脏、肾脏和肌肉组织的提取向试料中加入15mL提取溶剂和4个直径为10mm的钢球，在振荡器中，中速混合5min。于5000r/min和4℃条件下离心5min，移取上清液，于另一50mL刻度离心管中。向残渣中加入15mL提取溶剂，重复提取一次，合并2次上清液，用提取溶剂定容至30mL。加入2.0g无水Na2SO4，涡旋混合5min，于5000r/min和4℃条件下离心5min，取上清液作为备用液。7.1.2脂肪组织的提取向试料中加入15mL提取溶剂和4个直径为10mm的钢球，在振荡器中，中速混合5min，然后在2～8℃条件下冷藏15min。于8000r/min和20℃条件下离心10min，移取上清液，于另一50mL刻度离心管中。向残渣中加入15mL提取溶剂，重复提取一次，合并2次上清液，用提取溶剂定容至30mL。加入2.0g无水Na2SO4，涡旋混合5min，在2～8℃条件下冷藏30min，8000r/min和4℃条件下离心5min，取上清液作为备用液。7.2净化取硅胶固相萃取柱，加入1.0g无水Na2SO4，分别用甲醇6mL、乙酸乙酯5mL和提取溶剂5mL活化，取备用液6mL过柱，控制流速约2mL/min，依次用5mL正己烷、3mL淋洗溶剂淋洗，再用8mL洗脱溶剂洗脱；收集洗脱液，于35～40℃水浴中吹干，用中性甲醇1.0mL溶解残余物，涡旋混合15s，超声处理2min，再次涡旋混合，供液相色谱-串联质谱测定。对于脂肪提取物，在8000r/min和4℃条件下离心5min后用于测定。7.3基质匹配标准曲线制备取莫能菌素中间标准工作液（10µg/mL）适量，用中性甲醇稀释成浓度分别为2.5、5、20、50、100、200、500、1000、2000ng/mL的系列莫能菌素标准溶液，精密移取上述莫能菌素标准溶液各1mL，同时加入尼日利亚菌素校准内标工作液（2.5µg/mL）400µL，用中性甲醇稀释至10mL，混匀，分别移取1mL溶解由相应空白组织经样品前处理后获得的氮气吹干残余物，涡旋混合15s，超声处理2min，并再次涡旋混合，制成浓度分别为0.25、0.5、2、5、10、20、50、100、200ng/mL的基质匹配标准溶液。供液相色谱-串联质谱测定。以测得的莫能菌素特征离子峰面积与尼日利亚菌素特征离子峰面积之比作为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准曲线。求线性回归方程和相关系数。7.4测定7.4.1色谱参考条件a)色谱柱：ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6×50mm,3.5μm或相当者。b)流动相：A相为0.1%甲酸水溶液；B相为0.1%甲酸乙腈溶液，A+B=5+95（v/v）。c)流速：0.8mL/min。d)柱温：40℃。e)进样量：5µL。7.4.2质谱参考条件a)离子源：电喷雾离子源。b)扫描方式：正离子扫描。c)检测方式：多反应监测。d)碰撞气压力（CAD）：Medium。e)气帘气压力（CUR）：30psi。f)雾化气压力（GS1）：50psi。g)辅助加热气压力（GS2）：60psi。h)离子源喷雾电压（IS）：5500V。i)碰撞池出口电压（CXP）：13V。j)离子源温度（TEM）：500℃。待测物及内标定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞能量见表1。表1待测物及内标定性离子对、定量离子对及对应的去簇电压和碰撞能量化合物离子对（m/z）去簇电压DP（V）碰撞能量CE（V）莫能菌素693.5＞675.5a6049693.5＞479.467尼日利亚菌素（内标）747.6＞729.66057(a定量离子)7.5测定法7.5.1定性测定通过样品的保留时间与基质匹配标准溶液的保留时间、各色谱峰的特征离子与基质匹配标准溶液色谱峰的特征离子相对照定性。样品与基质匹配标准溶液的保留时间的相对偏差不大于2.5%；样品特征离子的相对丰度与基质匹配标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。表2定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度˃50%˃20%至50%˃10%至20%≤10%允许的相对偏差±20%±25%±30%±50%7.5.2定量测定取试样溶液和相应的基质匹配标准溶液，按内标法定量，标准溶液及试样溶液中莫能菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围内。7.6空白试验除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。8.结果计算和表达单点校准：''issisisSisAACCcAAC……………………（1）或标准曲线校准：由''SsisisACabAC求得a和b，则()isisCAcbaA…………………（2）按下式（3）计算试料中莫能菌素残留量：…………（3）式中：c——试样溶液中莫能菌素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；X——试料中莫能菌素的残留量，单位为微克每千克(µg/kg)；A——试样溶液中莫能菌素的峰面积；A’is——基质匹配标准溶液中尼日利亚菌素的峰面积；Cs——基质匹配标准溶液中莫能菌素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Cis——试样溶液中尼日利亚菌素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Ais——试样溶液中尼日利亚菌素的峰面积；As——基质匹配标准溶液中莫能菌素的峰面积；C’is——基质匹配标准溶液中尼日利亚菌素的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V1——备用液总体积，单位为毫升（mL）；V2——过柱备用液体积，单位为毫升（mL）；V3——最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——称样量，单位为克（g）；f——稀释倍数。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9.检测方法灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法在鸡的肌肉、肝脏、肾脏、皮+脂，牛的肌肉、肝脏、肾脏、脂肪中莫能菌素检测限均为0.25μg/kg，定量限均为0.5μg/kg。9.2准确度本方法对鸡肌肉、鸡肝脏、鸡肾脏、牛肌肉和牛肾脏在0.5～20µg/kg添加浓度水平，鸡皮+脂、牛肝脏、牛脂肪在0.5～200µg/kg添加浓度水平，莫能菌素的回收率均为60%～120%。9.3精密度本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。附录A（资料性附录）莫能菌素特征离子质量色谱图说明：1-莫能菌素特征离子质量色谱图（693.5＞675.5）2-莫能菌素特征离子质量色谱图（693.5＞479.4）3-尼日利亚菌素特征离子质量色谱图（747.6＞729.6）图1牛肝空白样品特征离子质量色谱图123说明：1-莫能菌素特征离子质量色谱图（693.5＞675.5）2-莫能菌素特征离子质量色谱图（693.5＞479.4）3-尼日利亚菌素特征离子质量色谱图（747.6＞729.6）图2牛肝基质匹配标准溶液特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)1122323说明：1-莫能菌素特征离子质量色谱图（693.5＞675.5）2-莫能菌素特征离子质量色谱图（693.5＞479.4）3-尼日利亚菌素特征离子质量色谱图（747.6＞729.6）图3牛肝添加样品特征离子质量色谱图(0.5μg/kg)3