BJS 201807 肉制品中刚果红的测定

附件2肉制品中刚果红的测定BJS2018071范围本方法规定了肉制品中刚果红的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于肉制品中刚果红的测定。原理试样经氨水乙醇溶液提取，用正己烷去除提取液中的脂肪后用液相色谱串联质谱法进行测定，外标法定量。试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的一级水。1.1试剂3.1.1乙腈（C2H3N）：色谱纯。3.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.3乙醇（C2H5OH）：色谱纯。3.1.4正己烷（C6H14）：优级纯。3.1.5甲酸铵（CH5NO2）：色谱纯。3.1.6氨水（NH3·H2O）：含量25%～28%。1.2试剂的配制3.2.1氨水乙醇溶液（20+80）：移取氨水（3.1.6）20mL，加入80ml乙醇（3.1.3），混匀备用。3.2.25mmol/L甲酸铵溶液：称取甲酸铵（3.1.5）0.315g，加适量的水溶解，定容至1000mL，混匀。1.3标准品刚果红标准样品的分子式、相对分子量、CAS登录号见表1，纯度≥98%表1刚果红标准样品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量刚果红CongoRed573-58-0C32H22N6Na2O6S2696.661.4标准溶液的配制称取10mg（精确到0.1mg）刚果红标准品于100mL量瓶中，加入少量甲醇溶解后，用甲醇定容，得到100μg/mL的标准储备溶液，4℃避光保存6个月。仪器和设备1.5液相色谱四极杆串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源1.6涡旋振荡器1.7组织捣碎机1.8高速离心机，10000r/min1.9电子天平，感量0.0001g和0.01g1.10旋转蒸发仪分析步骤1.11试样制备取适量有代表性的试样切成小块，组织捣碎机捣碎，均质分成两份，作为试样和留样，分别装入洁净容器中，密封并标记，于﹣18℃避光保存。1.12样品前处理准确称取2g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，加入10mL氨水乙醇溶液（3.2.1），在涡旋振荡器上提取2min后置于离心机中以5000r/min离心5min，把上层提取液溶液全部转移至另一离心管中，用10mL氨水乙醇溶液重复提取一次，合并提取液。在提取液中加入30mL正己烷于涡旋振荡器上混合2min后，5000r/min离心2min，弃去正己烷，将下层溶液全部转移至旋蒸瓶中，60℃下旋蒸至干，用5mL甲醇溶解残渣。取部分溶解液至离心管中，10000r/min离心10min后，取上清液上机测试。1.13仪器条件1.13.1液相色谱条件a）色谱柱：C18色谱柱（3.0mm×100mm，3.5μm），或性能相当者；b）流动相：流动相A为5mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈，流动相梯度洗脱程序见表2；2表2梯度洗脱程序时间/min流动相A（%）流动相B（%）080205.020806.080208.08020c）流速：0.3mL/min；d）柱温：35℃；e）进样量：1μL。2.1.1质谱条件a）电离方式：电喷雾负离子模式；b）检测方式：多反应监测（MRM）；c）雾化气压力：40psi；d）干燥气温度：320℃；e）干燥气流速：9.0L/min；f）毛细管电压：4.0kV；g）监测离子对、碎裂电压和碰撞能量见表3。3表3刚果红的监测离子对、碎裂电压和碰撞能量中文名称监测离子对(m/z）碎裂电压(V）碰撞能量(eV）刚果红325.0/152.013039325.0/416.0*13013注：*为定量离子对3.1定性确证进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准溶液一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度（k）与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表4中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测组分。4表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度/%k50%50%≥k20%20%≥k10%k≤10%允许的相对偏差/%±20±25±30±504.1定量测定4.1.1标准曲线的制备将刚果红标准溶液（3.4）用甲醇逐级稀释成0.25µg/mL、1µg/mL、5µg/mL、10µg/mL、20µg/mL的标准系列溶液，准确称取与试样基质相应的阴性试样2g（精确至0.01g，按5.2操作未检出325.0/152.0和325.0/416.0离子对），分别加入标准系列溶液1mL，与试样同时进行提取，制成最终浓度为0.05、0.2、1.0、2.0、4.0μg/mL标准系列工作溶液，将标准系列工作液上机测试，建立响应值与浓度的线性拟合方程。标准谱图见附录A。4.1.2试样溶液的测定将试样溶液（5.2）按仪器参考条件（5.3）进行测定，得到相应的试样溶液的质量色谱峰面积。根据标准曲线得到试样溶液中刚果红的浓度。4.2空白试验除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。结果计算按下式（1）计算试样中刚果红的含量：10001000cVXfm……………………………………(1）式中：X—试样中刚果红的含量，mg/kg；C—试样测定液中待测物含量，μg/mL；V—试样定容体积，mL；m—称取样品量，g；f—试样制备过程中的稀释倍数。测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留2位有效数字。灵敏度当称样量为2.00g时，本方法检出限为0.13mg/kg，定量限为0.45mg/kg。精密度和准确度在0.5mg/kg、1.0mg/kg及5.0mg/kg的添加水平下，回收率不低于70%，相对标准偏差不高于10%。附录A刚果红标准溶液质量色谱图图1100ng/mL刚果红多反应监测（MRM）色谱图本方法负责起草单位：南京市食品药品监督检验院。验证单位：江苏省食品药品监督检验研究院、国家肉类食品质量监督检验中心、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、北京市食品安全监控和风险评估中心、辽宁省食品检验研究院。主要起草人：凌睿、胡文彦、孙小杰、林慧、李志刚、马育松。