农业农村部公告 第350号2 常山酮残留检测方法标准(试行)

常山酮残留检测方法标准（试行）鸡组织中常山酮残留量的测定（试行）液相色谱-串联质谱法1范围本标准规定了鸡组织中常山酮残留检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于鸡的皮+脂中常山酮残留量的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试料中残留的常山酮用乙酸乙酯提取，乙酸铵缓冲溶液萃取，正己烷脱脂，提取液经HLB固相萃取柱净化，浓缩后供液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。4试剂与材料以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1氢溴酸常山酮对照品：含量≥99.0%。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4甲酸：色谱纯。4.5胰蛋白酶。4.6乙酸铵。4.7冰醋酸。4.8无水碳酸钠。4.9乙酸乙酯。4.1025mg/mL胰蛋白酶水溶液：称取胰蛋白酶5g，用水溶解并稀释至200mL。4.110.125mol/L乙酸铵缓冲溶液：称取乙酸铵9.64g，加冰醋酸15mL，用水溶解并稀释至1000mL，混匀。4.1210%碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠10g，用水溶解并稀释至100mL。4.130.1%甲酸溶液：量取甲酸1mL，用水稀释至1000mL，混匀。4.140.1%甲酸乙腈溶液：量取甲酸1mL，用乙腈稀释至1000mL，混匀。4.1550%乙腈溶液：量取乙腈和水按体积比50∶50，混匀。4.16稀释液：量取0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈溶液按体积比90∶10，混匀。4.171mg/mL氢溴酸常山酮标准储备液：精密称取氢溴酸常山酮对照品10mg，置于10mL量瓶中，用50%乙腈溶液溶解并定容至刻度，制成浓度为1mg/mL的氢溴酸常山酮标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。4.181μg/mL氢溴酸常山酮标准工作液：精密移取1mg/mL氢溴酸常山酮标准储备液100μL置于100mL量瓶中，用稀释液稀释并定容至刻度，制成浓度为1μg/mL的氢溴酸常山酮标准工作液，现配现用。4.1910μg/mL氢溴酸常山酮标准工作液：精密移取1mg/mL氢溴酸常山酮标准储备液1mL置于100mL量瓶中，用稀释液稀释并定容至刻度，制成浓度为10μg/mL的氢溴酸常山酮标准工作液，现配现用。5仪器和设备5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2分析天平：感量0.00001g。5.3天平：感量0.01g。5.4均质机。5.5离心机。5.6恒温水浴锅。5.7超声波清洗器。5.8涡旋振荡器。5.9酸度计。5.10固相萃取装置。5.11氮吹仪。5.12HLB固相萃取柱：500mg/6mL，或相当者。5.13微孔滤膜：0.22μm，有机系。6试样的制备与保存6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。——取均质后的供试样品，作为供试试料。——取均质后的空白样品，作为空白试料。——取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存-20℃以下保存。7测定7.1提取称取试料2±0.05g，于50mL离心管内，加入25mg/mL胰蛋白酶水溶液2mL，用10%碳酸钠溶液调pH值至7～8，在40℃水浴锅里酶解过夜。取出放至室温，加10%碳酸钠溶液1mL，混匀，加乙酸乙酯10mL，涡动1min，在冰水混合物中静置3min，立即4℃5000r/min离心3min。将上清液转入另一个干净的离心管中，置于冰水浴中。用乙酸乙酯10mL重复提取1次，合并乙酸乙酯层，加0.125mol/L乙酸铵缓冲溶液7.5mL，涡动1min，在冰水混合物中静置3min，立即4℃5000r/min离心3min，收集水层置于冰水浴中，用0.125mol/L乙酸铵缓冲溶液7.5mL再提取乙酸乙酯层1次。合并水层，加正己烷5mL，轻微振摇20s，5000r/min离心3min，除去多余的乙酸乙酯，弃去正己烷层，下层溶液再加正己烷5mL洗涤一次，弃去正己烷，下层溶液作为备用液。7.2净化HLB小柱依次用甲醇3mL、水3mL和0.125mol/L乙酸铵缓冲溶液3mL活化。取全部备用液过柱，用水3mL洗涤，然后用甲醇8mL洗脱，并收集洗脱液于10mL离心管中，于45℃水浴氮气吹干。用稀释液0.5mL溶解残余物，混匀，过0.22μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。7.3基质匹配标准曲线的制备分别精密移取1µg/mL氢溴酸常山酮标准工作液2.5、5、25µL，10µg/mL氢溴酸常山酮标准工作液5、25、50µL，依次加入6份经提取和净化处理的空白试料洗脱液中，于45℃水浴氮气吹干，用稀释液0.5mL溶解残余物，混匀，配成浓度为5、10、50、100、500和1000ng/mL的基质匹配系列标准溶液，过0.22μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。以测得特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制基质匹配标准曲线。7.4测定7.4.1液相色谱参考条件色谱柱：C18柱（2.1mm×50mm，1.7μm），或相当者；流动相：A：0.1%甲酸溶液；B：0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱：梯度洗脱程序见表1；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。表1梯度洗脱程序时间（min）A（%）B（%）梯度变化曲线09010-0.5901061.059561.559563.0901017.4.2质谱参考条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电离电压：3.0kv；离子源温度：100℃；雾化温度：350℃；锥孔气流速：25L/h；雾化气流速：650L/h。氢溴酸常山酮定性、定量离子对及对应的锥孔电压、碰撞能量见表2。表2定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量化合物定性离子对(m/z)定量离子对(m/z)锥孔电压(V)碰撞能量(eV)氢溴酸常山酮416.3138.3416.399.72018416.399.77.4.3测定法取试料溶液和基质匹配标准溶液，作单点校准，外标法定量。试料溶液及基质匹配标准溶液中常山酮的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试料溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表3的要求。空白组织溶液、基质匹配标准溶液和空白添加试样溶液中特征离子质量色谱图分别见附录A中图A.1～图A.3。表3试料溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对丰度（%）允许偏差（%）＞50±2020～50±2510～20±30≤10±507.4.4空白试验取空白试料，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。8结果计算和表述鸡组织中常山酮的残留量按下式计算：单点校准：式中：mAVACXssX——试料中常山酮的残留量，µg/kg；A——试样溶液中常山酮的峰面积；AS——基质匹配标准溶液中常山酮的峰面积；CS——基质匹配标准溶液中常山酮的浓度，µg/L；V——残余物定容体积，mL；m——供试试料质量，g；注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9检测方法灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度本方法的检测限为1.5μg/kg，定量限为5μg/kg。9.2准确度本方法在5μg/kg～400μg/kg添加浓度水平上的回收率为70～120%。9.3精密度本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。附录A（资料性附录）常山酮特征离子质量色谱图图A.1空白鸡皮+脂样品常山酮特征离子质量色谱图图A.2鸡皮+脂基质匹配样品常山酮特征离子质量色谱图（200μg/kg）图A.3鸡皮+脂添加样品常山酮特征离子质量色谱图（200μg/kg）JZKTime0.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40%01000.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40%010020171205003MRMof2ChannelsES+416.3138.32.12e31.611.912.3120171205003MRMof2ChannelsES+416.399.71.02e32.221.871.70JZF200PPBTime0.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40%01000.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40%010020171203011MRMof2ChannelsES+416.3138.38.57e41.3320171203011MRMof2ChannelsES+416.399.72.74e51.33JZT6200PPBTime0.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40%01000.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40%010020171203017MRMof2ChannelsES+416.3138.36.41e41.3320171203017MRMof2ChannelsES+416.399.71.90e51.33