BJS 201904 食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法

1附件4食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法BJS2019041范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。本方法适用于肉及肉制品中猪（Susscrofa）、驴（Equusasinus）、山羊（Caprahircus）、绵羊（Ovisaries）、牦牛（Bosgrunniens）、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。注：本方法中鼠源性成分包括海狸鼠（Myocastorcoypus）、小鼠（Musmusculus）、大鼠（Rattusnorvegicus）、豚鼠（Caviaporcellus）和竹鼠（Rhizomyspruinosus）源性成分。2原理提取样品DNA，通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品动物源性成分的定性分析。3试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1检测用引物和探针(a)猪cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’3’端引物：5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’探针：5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’(b)驴nad5基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’3’端引物：5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’探针：5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’(c)山羊cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’3’端引物：5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’探针：5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’(d)绵羊cytb基因检测用引物探针序列为：25’端引物：5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’3’端引物：5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’探针：5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’(e)牦牛cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’3’端引物：5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’探针：5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’(f)鼠cytb基因检测用引物探针序列为：5’端引物：5’-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’3’端引物：5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’探针：5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’3.2CTAB裂解液：2%(w/v)CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris，用10%盐酸调节pH至8.0，121℃高压灭菌20min，备用。3.3蛋白酶K：20mg/mL，-20℃保存备用。3.4苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇（体积比25∶24∶1）。3.5异丙醇，优级纯。3.670%乙醇。3.7实时荧光PCR预混液。以2×预混液为例，成分为：PCR缓冲液（终浓度1×），氯化镁（终浓度2.5mmol/L），dNTP（终浓度0.2mmol/L），TaqDNA聚合酶（终浓度1U）。3.8TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。4仪器和设备4.1组织研磨器。4.2核酸蛋白分析仪。4.3恒温水浴锅。4.4离心机（最大离心力≥12000g）。4.5微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL）。4.6实时荧光PCR仪。4.7涡旋振荡器。4.8电子天平：感量0.01g。4.9高压灭菌锅。4.10pH计。5分析步骤35.1试样选取与制备多点采取肌肉组织，选取适量具有代表性的样品进行均质处理。所用器皿应为一次性耗材，或经过彻底清洗和高压消毒并单独使用。用过的器皿应采取措施消除核酸的污染，否则不可重复使用。5.2DNA提取称取解冻后的均质样品0.1g~0.2g，置于2mL离心管中，加入600μLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃孵育1h~2h，期间每隔10min振荡混匀；加入500μL的苯酚：三氯甲烷：异戊醇（25∶24∶1），充分振荡混匀，12000g离心5min；小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，振荡混匀，12000g离心5min；弃去上清液，500μL70%乙醇洗涤2次，12000g离心5min，弃上清液，晾干；加入50µL~100µLTE缓冲液或无菌双蒸水，溶解DNA，-20℃保存备用。同法提取阳性对照、阴性对照及空白对照。也可用等效商品化的试剂盒提取DNA。5.3DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度，DNA浓度在1ng/μL~100ng/μL之间，A260/A280值在1.7~2.0之间时，适宜于本方法。5.4实时荧光PCR扩增各动物源性成分PCR扩增均采用20μL的反应体系，包括PCR反应预混液（2×）10μL，5’端、3’端引物（10μmol/L）各0.2μL，探针（10μmol/L）0.1μL，DNA模板（1ng/μL~100ng/μL）1μL，用无菌双蒸水补足20μL。每个样品设置两个平行反应体系。PCR扩增反应程序为：95℃5min；35个循环（95℃15s，58℃1min，收集荧光）。也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。5.5实验对照实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。用相应动物源性成分生鲜肉样品作为阳性对照，用不含相应动物源性成分的生鲜肉样品作为阴性对照，用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。6结果判断与表述6.1质量控制(a)空白对照：无FAM荧光信号检出；(b)阴性对照：无FAM荧光信号检出；(c)阳性对照：有FAM荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线，Ct值≤30.0。否则判定为实验无效。6.2结果判定4(a)如有FAM荧光信号检出，Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，则判定为被检样品阳性；(b)如Ct值≥35或无Ct值，则判定为被检样品阴性；(c)如有FAM荧光信号检出，且30.0＜Ct值＜35.0，则重新进行实验。如再次扩增后Ct值仍＜35.0，且有典型的扩增曲线，则判定被检样品阳性；否则判定被检样品阴性。6.3结果表述结果为阳性者，表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者，表述为“未检出XX源性成分”。7污染判定在DNA浓度相对差值在20%以内的情况下，本方法所检测生鲜肉与阳性对照差值＞6，或肉制品与阳性对照差值＞10，且结果可独立重复，提示该源性成分含量低于2%。8防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。本方法负责起草单位：成都市食品药品检验研究院、中国科学院成都生物研究所、北京维德维康生物技术有限公司。验证单位：山东省食品药品检验研究院、中国检验检疫科学研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、河北省食品检验研究院、国家副食品质量监督检验中心，广州质量监督检测研究院。主要起草人：梁恒兴、尚柯、段庆梓、唐卓、张彪、马立才。