BJS 201904 食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法

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1附件4食品中多种动物源性成分检测实时荧光PCR法BJS2019041范围本方法规定了肉及肉制品中猪、驴、山羊、绵羊、牦牛、鼠源性成分检测的实时荧光PCR方法。本方法适用于肉及肉制品中猪(Susscrofa)、驴(Equusasinus)、山羊(Caprahircus)、绵羊(Ovisaries)、牦牛(Bosgrunniens)、鼠源性成分的一种或多种成分同时定性检测。注:本方法中鼠源性成分包括海狸鼠(Myocastorcoypus)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、豚鼠(Caviaporcellus)和竹鼠(Rhizomyspruinosus)源性成分。2原理提取样品DNA,通过特异性引物探针进行动物源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中产物荧光信号及扩增曲线判定,实现对样品动物源性成分的定性分析。3试剂和材料除另有规定外,本方法所用试剂为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。3.1检测用引物和探针(a)猪cytb基因检测用引物探针序列为:5’端引物:5’-GCACTTTATCCTGCCATTCATCATT-3’3’端引物:5’-GTACAAGGATTAGTAGGATTAGT-3’探针:5’-FAM-CGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTA-BHQ1-3’(b)驴nad5基因检测用引物探针序列为:5’端引物:5’-GCTAGCCTCATTATCAGTAT-3’3’端引物:5’-GTGATGAGGATACGTGCT-3’探针:5’-FAM-TCATATCATCAATCCTCAACACCCACA-BHQ1-3’(c)山羊cytb基因检测用引物探针序列为:5’端引物:5’-CTTTATCCTCCCATTCATCATCA-3’3’端引物:5’-GAATTCCTGTGGGGTTGTTC-3’探针:5’-FAM-GCTCTCGCCATAGTCCACCTGCTTTTC-BHQ1-3’(d)绵羊cytb基因检测用引物探针序列为:25’端引物:5’-CTCATGCTACTAGTACTATTTACG-3’3’端引物:5’-GTACGCGAATAGGAAGTATCAT-3’探针:5’-FAM-TGACTTACTCGGAGACCCAGACAACTACAC-BHQ1-3’(e)牦牛cytb基因检测用引物探针序列为:5’端引物:5’-AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA-3’3’端引物:5’-CGTCTCGGCAGATATGGACA-3’探针:5’-FAM-CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT-BHQ1-3’(f)鼠cytb基因检测用引物探针序列为:5’端引物:5’-CTCCACGAGACAGGATCAAACAACCCATCAGGACTAAA-3’3’端引物:5’-TCATTCTGGTTTGATGTGGGGTGGGGTATT-3’探针:5’-FAM-TAGTGGGTTAGCAGGTGTGTAGTTGTCTGGGTCTC-BHQ1-3’3.2CTAB裂解液:2%(w/v)CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris,用10%盐酸调节pH至8.0,121℃高压灭菌20min,备用。3.3蛋白酶K:20mg/mL,-20℃保存备用。3.4苯酚∶三氯甲烷∶异戊醇(体积比25∶24∶1)。3.5异丙醇,优级纯。3.670%乙醇。3.7实时荧光PCR预混液。以2×预混液为例,成分为:PCR缓冲液(终浓度1×),氯化镁(终浓度2.5mmol/L),dNTP(终浓度0.2mmol/L),TaqDNA聚合酶(终浓度1U)。3.8TE缓冲液(Tris-HCl、EDTA缓冲液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。4仪器和设备4.1组织研磨器。4.2核酸蛋白分析仪。4.3恒温水浴锅。4.4离心机(最大离心力≥12000g)。4.5微量移液器(0.1μL~2.5μL,0.5μL~10μL,10μL~100μL,100μL~1000μL)。4.6实时荧光PCR仪。4.7涡旋振荡器。4.8电子天平:感量0.01g。4.9高压灭菌锅。4.10pH计。5分析步骤35.1试样选取与制备多点采取肌肉组织,选取适量具有代表性的样品进行均质处理。所用器皿应为一次性耗材,或经过彻底清洗和高压消毒并单独使用。用过的器皿应采取措施消除核酸的污染,否则不可重复使用。5.2DNA提取称取解冻后的均质样品0.1g~0.2g,置于2mL离心管中,加入600μLCTAB裂解液和20μL蛋白酶K,振荡混匀,65℃孵育1h~2h,期间每隔10min振荡混匀;加入500μL的苯酚:三氯甲烷:异戊醇(25∶24∶1),充分振荡混匀,12000g离心5min;小心吸取上清液至洁净的1.5mL离心管内,加入等体积的异丙醇,振荡混匀,12000g离心5min;弃去上清液,500μL70%乙醇洗涤2次,12000g离心5min,弃上清液,晾干;加入50µL~100µLTE缓冲液或无菌双蒸水,溶解DNA,-20℃保存备用。同法提取阳性对照、阴性对照及空白对照。也可用等效商品化的试剂盒提取DNA。5.3DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度及纯度,DNA浓度在1ng/μL~100ng/μL之间,A260/A280值在1.7~2.0之间时,适宜于本方法。5.4实时荧光PCR扩增各动物源性成分PCR扩增均采用20μL的反应体系,包括PCR反应预混液(2×)10μL,5’端、3’端引物(10μmol/L)各0.2μL,探针(10μmol/L)0.1μL,DNA模板(1ng/μL~100ng/μL)1μL,用无菌双蒸水补足20μL。每个样品设置两个平行反应体系。PCR扩增反应程序为:95℃5min;35个循环(95℃15s,58℃1min,收集荧光)。也可用等效的商品化试剂盒进行扩增。5.5实验对照实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。用相应动物源性成分生鲜肉样品作为阳性对照,用不含相应动物源性成分的生鲜肉样品作为阴性对照,用等体积的无菌双蒸水代替模板DNA作为空白对照。6结果判断与表述6.1质量控制(a)空白对照:无FAM荧光信号检出;(b)阴性对照:无FAM荧光信号检出;(c)阳性对照:有FAM荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值≤30.0。否则判定为实验无效。6.2结果判定4(a)如有FAM荧光信号检出,Ct值≤30.0,且出现典型的扩增曲线,则判定为被检样品阳性;(b)如Ct值≥35或无Ct值,则判定为被检样品阴性;(c)如有FAM荧光信号检出,且30.0<Ct值<35.0,则重新进行实验。如再次扩增后Ct值仍<35.0,且有典型的扩增曲线,则判定被检样品阳性;否则判定被检样品阴性。6.3结果表述结果为阳性者,表述为“检出XX源性成分”。结果为阴性者,表述为“未检出XX源性成分”。7污染判定在DNA浓度相对差值在20%以内的情况下,本方法所检测生鲜肉与阳性对照差值>6,或肉制品与阳性对照差值>10,且结果可独立重复,提示该源性成分含量低于2%。8防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。本方法负责起草单位:成都市食品药品检验研究院、中国科学院成都生物研究所、北京维德维康生物技术有限公司。验证单位:山东省食品药品检验研究院、中国检验检疫科学研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、河北省食品检验研究院、国家副食品质量监督检验中心,广州质量监督检测研究院。主要起草人:梁恒兴、尚柯、段庆梓、唐卓、张彪、马立才。

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