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附件1兽药中非法添加四环素类药物的检查方法1适用范围1.1本方法适用于麻杏石甘散、银翘散、替米考星预混剂、氟苯尼考预混剂、磺胺氯吡嗪钠可溶性粉中非法添加土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素的检查。1.2用于其他兽药制剂中非法添加土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素等四环素类药物检查时，需进行空白试验和检测限测定。2检查方法照高效液相色谱法（《中国兽药典》一部附录0512）测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L草酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱；二极管阵列检测器检测，采集波长范围为200～400nm，分辨率为1.2nm；记录350nm波长处的色谱图。取土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素及多西环素对照品适量，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含10µg的溶液，作为系统适用性溶液，取20µL注入液相色谱仪，同时记录光谱图和色谱图，出峰顺序依次为土霉素、四环素、金霉素、多西环素，相邻峰之间的分离度均应符合要求。供试品溶液中如有土霉素、四环素、金霉素或多西环素峰，与相邻峰的分离度应符合要求。时间（min）A%B%0901039010157030207030229010测定法取供试品1.0g，置锥形瓶中，加0.01mol/L的盐酸溶液100ml，超声处理5分钟，摇匀，滤过，取滤液5.0ml，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至25ml，摇匀，作为供试品溶液。另取土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素对照品适量，用0.01mol/L的盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中各约含10µg的溶液，作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各20µL注入液相色谱仪，同时记录色谱图和光谱图。必要时，可调整供试品溶液或对照品溶液的浓度，使两者峰面积近似。通过与对照品溶液色谱图保留时间、光谱图的比对，确定供试品中是否含有土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素。3结果判定3.1供试品溶液色谱图中如出现与土霉素、四环素、金霉素或多西环素对照品保留时间一致的峰（差异小于等于±5%），且为单一物质峰；在规定的采集波长范围内，两者紫外光谱图匹配，且最大吸收波长一致（差异小于等于±2nm），判定为检出土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素。3.2供试品溶液色谱图中峰保留时间与土霉素、四环素、金霉素或多西环素对照品峰一致，但峰面积小于检测限峰面积，判定为未检出土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素或多西环素。4检测限本方法检测限土霉素、盐酸四环素为0.5g/kg，盐酸金霉素、多西环素为1.0g/kg。附图1：四环素类药物混合标准溶液色谱图注：出峰顺序依次为：土霉素、四环素、金霉素、多西环素附图2：四环素类药物混合标准溶液光谱图