脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定在逆境条件下，植物体内脯氨酸（proline，Pro）的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低凝固点，有防止细胞脱水的作用。在低温条件下，植物组织中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作为抗寒育种的生理指标。一、原理当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即为红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料待测植物叶片（二）仪器设备1.722型分光光度计；2.研钵；3.100ml小烧杯；4.容量瓶；5.大试管；6.普通试管；7.移液管；8.注射器；9.水浴锅；10.漏斗；11.漏斗架；12.滤纸；13.剪刀。（三）试剂1.酸性茚三酮溶液：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml6mol/l磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。2.3%磺基水杨酸：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。3.冰醋酸。4.甲苯。三、实验步骤1.标准曲线的绘制（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯中内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。（2）系列脯氨酸浓度的配置：取6个50ml容量瓶，分别加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。（3）取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30min。（4）冷却后各试管准确加入4ml甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。（5）用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2ml测定液中脯氨酸的含量（ug/2ml）。2.样品的测定（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入3%的磺基水杨酸溶液5ml，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。（3）冷却后加入4ml甲苯，摇荡30s，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min下离心5min。（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得吸光度值。四、结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（X，ug/2ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：单位鲜质量样品的脯氨酸含量（%）=𝑋×𝑉𝑡𝑊×𝑉𝑠×106x100式中：X为从标准曲线查出的2ml测定液中脯氨酸的含量（ug/2ml）；Vt为提取液体积（ml）；Vs为测定时取用的样品体积（ml）；W为样品质量（g）。植物体内硝酸还原酶活力的测定硝酸还原酶（NR），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO3-＋NADH＋H+𝑁𝑅→NO2-＋NAD+＋H2O）。产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）α-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以ug氮/（g·h）为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法操作简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。离体法一、材料、仪器设备及试剂（一）材料水稻、小麦叶片、幼穗等。（二）仪器设备1.冷冻离心机2.分光光度计3.天平（感量0.1mg）4.冰箱5.恒温水浴6.研钵7.剪刀8.离心管9.具塞试管10.移液管11.吸尔球。（三）试剂1.亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准液。2.0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液：30.0905gNa2HPO4·12H2O与2.4965gNaH2PO4·2H2O加去离子水溶解后定容至1000ml。3.1%（质量浓度）磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100ml3mol/l盐酸中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/lHCl）。4.0.02%（质量浓度）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶内。5.0.1mol/lKNO3溶液：2.5275gKNO3溶于250ml0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液。6.0.025mol/lpH8.7的磷酸缓冲液：8.8640gNa2HPO4·12H2O，0.0570gK2HPO4·3H2O溶于1000ml去离子水中。7.提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100ml0.025mol/lpH8.7的磷酸缓冲液中。8.2mg/mlNADH溶液：2mgNADH溶于1ml0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液中（临用前配制）。二、实验步骤（一）标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按下表顺序加入试剂，配成0~2.0ug的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在25℃下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光度值为纵坐标（Y）建立回归方程。配置标准溶液时各物质加入量试剂/ml管号1234567亚硝酸钠标准液00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.401%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺4444444每管含亚硝态氮/ug00.20.40.81.21.62.0（二）样品中硝酸还原酶活力测定1.酶的提取：称取0.5g鲜样，剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min，取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取缓冲液，研磨匀浆，转入离心管在4℃、4000r/min下离心15min，上清液即为粗酶提取液。2.酶的反应：取粗酶液0.4ml于10ml试管中，加入1.2ml0.1mol/lKNO3磷酸缓冲液和0.4mlNADH溶液，混匀，在25℃水浴中保温30min，对照不加NADH溶液，而以0.4ml0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液代替。3.终止反应和比色测定：保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应，再加1ml萘基乙烯胺溶液，显色15min后于4000r/min下离心15min，取上清液在540nm下比色测定。根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量（ug）。三、结果计算样品中硝酸还原酶活性［ug/（g▪h）］＝𝑥𝑉𝑠×𝑉𝑇𝑊×𝑡其中：x为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量（ug）；VT为提取酶时加入的缓冲液体积（ml）；Vs为酶反应时取用的粗酶液体积（ml）；W为样品鲜质量（g）；t为反应时间（h）。根系活力的测定（TTC法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部分的生长、营养状况及产量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙。生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二醛、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂（一）材料水培或沙培小麦、玉米等植物根系。（二）仪器设备1.分光光度计2.分析天平（感量0.1mg）3.电子顶载天平（感量0.1g）4.温箱5.研钵6.50ml三角瓶7.漏斗8.100ml量筒9.10ml吸量管10.10ml刻度试管11.试管架12.10ml容量瓶13.药勺14.石英砂适量15.10ml、1000ml烧杯。（三）试剂1.乙酸乙酯（分析纯）2.次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3.1%TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容至100ml。用时稀释至所需要的各种浓度。4.磷酸缓冲液（1/15mol/lpH7）：准确称取9.067g磷酸二氢钾（KH2PO4），加1mol/lNaOH溶液38.8ml，并加水定容至1000ml（或者1/15mol/l的磷酸氢二钠：称取Na2HPO4·12H2O23.88g蒸馏水定容至1000ml；1/15mol/l的磷酸二氢钾：称取分析纯KH2PO49.07g，用纯水定容至1000ml。pH7的磷酸缓冲液即为取1/15mol/l的磷酸氢二钠12ml，1/15mol/l的磷酸二氢钾8ml，两者混合即可。）5.1mol/l硫酸：用量筒取相对质量1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。三、实验步骤定量测定（1）TTC标准曲线的制作：取0.4%TTC溶液0.25ml放入10ml试管中，加少许Na2S2O4粉末摇匀后立即产生红色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.2~0.3g，放入10ml烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液各5ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1~3h，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比，测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算单位质量鲜根的四氮唑还原强度［mg/（g▪h）］＝𝐶𝑊×𝑡式中：C为从标准曲线查出的四氮唑还原量（mg）；W为样品重量（g）；t为反应时间（h）。