技术咨询电话:400-607-9999注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途胞核胞浆胞膜制备试剂盒Nucl-Cyto-MemPreparationKit货号:P060004描述:从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮培养细胞中,制备细胞核、细胞膜与胞内质膜、细胞浆等三种主要亚细胞组分。独特的试剂成分与优化的制备方案相结合,使胞核-胞膜-胞浆制备过程简单易行,无需特殊设备和超速离心,制备过程可在1小时内完成。制备的细胞核、细胞浆组分纯度甚高,而且较少交叉污染。单一的细胞膜的纯化是一个特殊问题,本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器如线粒体、内质网、高尔基体及其质膜的混合物。制备的细胞核是完整的未裂解的细胞核,但胞浆组分为可溶性胞浆蛋白。制备的亚细胞组分的纯度可胜任后续免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-Dgel电泳、WesternBlotting、酶活性测定、受体分析等。组成:(50extractions,8x106cellsperextraction)CER,CytosolExtractionReagent,25ml;MER,MembraneExtractionReagent,2.5mlNER,NuclearExtractionReagent,50ml;SuspensionBuffer,10ml储存:4ºC避光保存1年。收集细胞:准确计数,每一制备使用等量的细胞数,将明显改善后续检测结果的一致性。每一制备约需要8x106~1x107个细胞。贴壁细胞:PBS冲洗细胞皿,胰蛋白酶消化细胞。800xg离心5-10min。弃上清,用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。注意:为避免胰蛋白酶在后续制备过程中降解蛋白质,可用无酶细胞消化液(Non-enzymeCellDisassociationSolution)使贴壁培养的细胞与瓶皿分离。技术咨询电话:400-607-9999注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途悬浮细胞:800xg离心5-10min。弃上清。用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。估计细胞沉淀压积PCV(packedcellvolume):通常1x106个细胞离心后的PCV约为10-20l,1x107个细胞的PCV约为100l。注意PCV大小与细胞数量有关,也与细胞类型、大小、离心速度有关。制备步骤制备全程在4ºC或冰水浴中进行。1.1细胞匀浆裂解每1x107个细胞或~100lPCV的细胞沉淀加入500lCER试剂,震荡重悬。冰浴2min。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内。冰上上下手动匀浆20-30次。注意:破碎细胞是关键环节。用1-3ml小容积玻璃匀浆器,须选用间隙严密的研杵,其特征是将研杵插入匀浆器套管后,可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉研磨而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关。可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应少于5%。1.2组织块匀浆裂解取250mg哺乳动物新鲜或-80ºC冻存的组织块,勿剪碎为更小的块。放入冰预冷的玻璃匀浆器内。加入500lCER试剂。用研杵旋转将组织块捣碎,上下手动预匀浆20次。冰浴10min。然后上下手动预匀浆7次。注意:与培养细胞特别是贴壁细胞相比,组织块中的细胞在匀浆时较易破碎,因而并非必须选用间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密,组织匀浆困难,可选用研杵与套管稍松的匀浆器。破碎效果与组织细胞类型有关。可在相差显微镜下检查,未裂解细胞应少于5%。2.取出~500l裂解混合物,转移到1.5ml离心管。800×g,4ºC离心5min。粗细胞核沉淀在管底,上清为胞膜-胞浆混合物。按照以下步骤首先制备膜与胞浆,然后制备细胞核,或用两台离心机同时制备。3.膜与胞浆制备:3.1.将步骤2获得的上清液转移到新管,估计上清液体积;3.2.立即加入1/10积量的MER与上清液混合。冰浴5分钟;3.3.最大转速14,000rpm4ºC离心30分钟;技术咨询电话:400-607-9999注意:本制品仅供研究使用,请勿用于临床治疗等其他用途3.4.取出上清液转移到新管,此为胞浆组分;3.5.沉淀为胞膜组分,含细胞膜和细胞内质膜的混合物。再次瞬时离心除尽液体,用100l或适宜体积的SuspensionBuffer或自备溶液重悬胞膜。4.细胞核制备:4.1.加入500lNER,振荡重悬步骤2获得的粗核。必要时按步骤1.1匀浆胞核;4.2.4000×g,4ºC离心5min。弃上清;4.3.再次加入500lNER洗涤胞核沉淀,并重复步骤4.2,离心后的上清应清亮;4.4.弃上清除尽液体。用100l或适宜体积SuspensionBuffer或自备溶液重悬细胞核。说明1.制备的胞浆组分或重悬于SuspensionBuffe的胞膜胞核组分可进行Bradford法、Lowry法、BCA法蛋白定量、酶活性测定、受体分析。但进行免疫共沉淀、SDS-PAGE、2-Dgel电泳、WesternBlot之前,需要1:1加入自备的2x样品缓冲液(含适宜浓度的去垢剂如NP-40、TritonX-100、SDS)。用户可不用Kit中的SuspensionBuffer,而直接用自行配制的样品缓冲液重悬胞核或胞浆沉淀,但这是要考虑自配缓冲液中是否有影响蛋白定量的因素。2.用SDS-PAGELoading缓冲液裂解细胞核后,DNA释放会使核裂解物十分粘稠,可95ºC加热5min,高速振荡打断DNA,重复加热2-3次。3.如果为凝胶阻滞实验(EMSA)目的提取核蛋白,建议用#P1200:核-胞浆蛋白制备试剂盒(Nuclear-CytosolExtractionKit),该试剂盒并非提取完整的细胞核,而是直接提取可溶性核蛋白,可用于EMSA或WesternBlot分析。4.试剂盒不包含蛋白酶抑制剂。通常4ºC操作不用蛋白酶抑制剂不会出现问题。