环境微生物学实验

海南大学环境与植物保护学院谭志琼环境微生物学实验海南大学环境与植物保护学院谭志琼用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。海南大学环境与植物保护学院谭志琼简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。海南大学环境与植物保护学院谭志琼一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。内容：1、学习细菌单染色操作技术。2、学习革兰氏染色技术。3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。海南大学环境与植物保护学院谭志琼二、实验材料和用具1、单染色法：（1）大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的斜面菌种。（2）吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水（3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。海南大学环境与植物保护学院谭志琼2、革兰氏染色：（1）黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l～2种；（2）革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、（3）香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。海南大学环境与植物保护学院谭志琼3、荚膜染色：(l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3—5天的团褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)或者培养2—3天的硅酸盐细菌(Bacillusmucilaginosussubspsilicus)(2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。(3)载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜。海南大学环境与植物保护学院谭志琼4、鞭毛染色：(1)在牛内膏蛋白胨斜面上培养19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培养体在取用前经过每日移植—代，连续移植5～7代。(2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。(3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。(4)显微镜．海南大学环境与植物保护学院谭志琼5、芽孢染色：(1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。(2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。(3)显微镜。(4)香柏油、二甲苯、擦镜纸．(5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。海南大学环境与植物保护学院谭志琼三、操作步骤一、单染色法（1）涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水（图4－10a），用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2（图4－10b）。（2）干燥将涂片于室温中自然干燥。（3）固定手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图4—10c)。海南大学环境与植物保护学院谭志琼（4）染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。（5）水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止(图4—10e)。（6）干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体(图4—10f)。（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。海南大学环境与植物保护学院谭志琼图4－10单染色方法海南大学环境与植物保护学院谭志琼（二）革兰氏染色法1、制片（1）涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（2）干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。（3）固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片面向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。海南大学环境与植物保护学院谭志琼2、染色（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。海南大学环境与植物保护学院谭志琼3、结果革兰氏阳性菌染成篮紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。4、检测未知菌用以上方法对未知面进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。海南大学环境与植物保护学院谭志琼1．石炭酸复红染色(1)取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(荚膜是多糖类物质，不可用火焰烘干)。(2)滴入1～2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。(3)加石炭酸复红染液染色1～2min，水洗，自然干燥。(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触，在以匀速推向另一端，涂成均匀的一薄层，自然干燥。(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。（三）荚膜染色法海南大学环境与植物保护学院谭志琼2．背景染色(1)先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。(3)干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗．在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。海南大学环境与植物保护学院谭志琼3．李夫森氏－硼酸钠美兰染色（1）取在阿须贝氏无氮培养基上培养3天的硅酸盐细菌少许，制成干燥涂片(不要加热固定)。（2）加李夫森氏染色液染色l0min，倾之染液(勿用水洗)。（3）加硼酸钠美兰染色液染色5min，水洗，晾干。（4）油镜视察可见荚膜被染成红色，菌体处成蓝色。海南大学环境与植物保护学院谭志琼（四）鞭毛染色法1．方法一：（1）用接种环由培养18～20h的斜面上取假单胞菌菌体少许，用菌滴制片法检查细菌的运动性。如果菌体的运动性很强，则可作鞭毛染色。（2）用3～4mL无菌水，将培养体洗下，移入另一无菌试管中，适温培养10min，再检查运动性。海南大学环境与植物保护学院谭志琼（3）用无菌吸管由悬液上部取一小滴，置于一清洁载玻片的一端，将玻片倾斜。使菌液由一端流向另外一端。于是在玻片上做成2～3条菌液带。待水膜自然干燥（切勿用火焰烘）。（4）用刚刚过滤的鞭毛染色液A染色5min(不要加热)。（5）倾去A液，加鞭毛染色液B染色10min。用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。（6）用齐氏石炭酸复红染色2～3min。轻轻冲洗，晾干(不能用吸水纸吸干)。（7）先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜检查。海南大学环境与植物保护学院谭志琼2．方法二：（1）制涂片：先加少量无菌蒸馏水于凹载玻片的凹窝中．再从培养10h左右的斜面菌苔上取菌一环，轻放在凹窝水面上(不要搅动)，放30度温箱静置5～10min．取出，从凹窝水面上轻轻取菌液一环，轻放在干净的载玻片上(不要涂抹)，放回温箱，让其自然干燥(不要加热固定)。（2）染色：在自然干燥的涂片上，滴加含石炭酸的鞭毛染色液一滴，染色5min，用水轻轻冲洗，让其自然干燥。（3）镜检：用油镜观察。海南大学环境与植物保护学院谭志琼（五）芽孢染色法1．方法一：(1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)于载片上滴人3～5滴5％孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。海南大学环境与植物保护学院谭志琼2．方法二：(1)加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环培养18～24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分均匀打散，制成浓稠的菌液。(2)加5％孔雀绿水溶液2～3滴于小试管中．用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。(3)将此试管浸干沸水浴(烧杯)中，加热15～20min。(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片经过微火3次固定。(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。(6)加沙黄水溶液，染2～3min后，倾去染液，不用水洗。(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。海南大学环境与植物保护学院谭志琼四、注意事项1．载玻片要洁净无脂，否则菌液涂不开。涂片时，滴水不要过多，挑菌量宜少，菌膜宜薄，切忌过厚。2．在染色过程中，不可使染液干涸。3.在革兰氏染色过程中脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌，另外，老龄菌因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。3.荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。4.鞭毛染色液最好当日配置，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。5．供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。海南大学环境与植物保护学院谭志琼五、实验报告(一)绘图1．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。2．大肠杆菌革兰氏染色视野图。3．金黄色葡萄球菌革兰氏染色视野图。4．褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。4．绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。6．枯草芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。(二)单染色法操作要点。(三)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。海南大学环境与植物保护学院谭志琼六、问题和思考1．涂片在染色前为什么要先进行固定?固定时应注意什么问题?2．制备染色装片时应注意哪些事项，为什么?制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？3．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么?4．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。5．组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?6．鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种?7．根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?海南大学环境与植物保护学院谭志琼实验二微生物的接种技术海南大学环境与植物保护学院谭志琼微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。无菌操作是微生物接种技术的关键。斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等。海南大学环境与植物保护学院谭志琼一、实验目的：了解各种微生物接种方法：斜面接种技术液体接种技术固体接种技术穿刺接种技术海南大学环境与植物保护学院谭志琼二、实验材料和用具：已灭菌培养基、接种环、接种针、酒精灯、移液管、记号笔海南大学环境与植物保护学院谭志琼三、实验步骤：1、斜面接种技术斜面接种是从已生长好的