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B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程1、预期用途该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E基因突变。B-raf基因是一种癌基因，编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA长2.5kb，编码783氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000Da。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-raf突变，B-raf突变主要发生在Exon15上的激活区的第1799氨基酸上(T突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf激酶活性提高，V600E突变能模拟T598和S601两个位点磷酸化作用，使BRAF蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf基因V600E突变患者，抗EGFR单抗治疗无效。2010年版《NCCN结直肠癌临床实践指南》中已明确指出“如K-ras基因无突变时，需检测B-raf基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR单抗治疗。”2、仪器配置要求移液器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler®480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。3、耗材要求无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。4、责任人基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。5、执行人操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。6、检测原理本产品选取人类基因组B-raf基因Exon15上设计特异性引物和探针，对扩增后的PCR产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染。7、试剂来源北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司8、样本要求8.1用量：每例标本切5张(10µm)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5mlEP管中；8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本；8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需要加同一组织HE染色片子一张（在显微镜下肿瘤细胞比例＞70%）。9、标准操作程序9.1试剂准备（在试剂准备区完成）9.1.1配置说明：检测反应设置阴性质控品和阳性质控品。9.1.2配置过程提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。确定反应数N，N=待检样本数(n)+质控品数(2)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下（表2）：试剂B-rafPCR反应液CB-raf引物探针混合液纯化水用量(μl)12.5×N4.5×N6×N取1个灭菌离心管配置上述反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。然后将上述混合液23μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。配完试剂后，充分混合均匀，瞬时离心15sec，放入传递窗。9.2标本制备（标本制备去完成）9.2.1在缓冲间内更换隔离衣，戴上帽子、口罩、手套，将传递窗的试剂取出放入标本制备区的冰箱冷藏，备用。9.2.2从样本盒中取出待检石蜡组织样本，添加1ml二甲苯于样品中，剧烈涡旋10sec。12000rpm离心2min，吸除上清，小心不要吸到沉淀。9.2.3加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。12000rpm离心2min，吸除上清，小心不要吸到沉淀。9.2.4打开管盖，室温（15℃-25℃）或者37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全。注意：完全去除残余的乙醇很重要，任何残余的乙醇均会对DNA产生影响。9.2.5重悬沉淀于180ul缓冲液GA中，加入20ul蛋白酶K，彻底涡旋均匀。56℃水浴1小时（水浴到样本完全裂解为止），再转移到90℃孵育1小时。9.2.6向离心管中添加200ul缓冲液GB，涡旋均匀。加入200ul无水乙醇，涡旋均匀。再加入200ul无水乙醇，彻底均匀。9.2.7将上述得到的溶液加入吸附柱CR2中（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心1min。将离心出的溶液重新加入到吸附柱中，12000rpm再次离心1min，直到所有的溶液通过吸附柱，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9.2.8向吸附柱中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9.2.9向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9.2.10重复步骤15。9.2.11将上步实验所得吸附柱12000rpm离心3min，弃掉收集管及废液，将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，打开吸附柱的盖子置于室温放置数分钟。注意：此步骤目的是使吸附柱中残余的漂洗液挥发干净，漂洗液的残留，可能会影响后续的实验。9.2.12向吸附柱膜的中央滴加20-50ul洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液。9.2.13加样将B-raf阴性质控品C、已处理样本和B-raf阳性质控品C分别取2μL加入PCR反应管中，盖紧管盖，瞬时离心将管壁上的液体全部甩至管底，避免产生气泡，如有气泡产生，轻弹PCR反应管壁，再次瞬时离心（若仍有气泡重复此步骤），然后立即进行PCR扩增反应。9.3PCR扩增9.3.1PCR扩增程序设定序号阶段温度时间循环数1UDG酶反应37℃2分钟12预变性95℃3分钟13变性94℃15秒154退火、延伸、荧光信号采集(FAM荧光)60℃35秒5变性94℃5秒306退火，延伸70℃2分钟7变性78℃15秒8退火，延伸，荧光信号采集(FAM荧光)60℃45秒9仪器冷却25℃1分钟1收集荧光：FAM通道10、PCR结果分析10.1结果分析条件设定10.1.1ABI7500型荧光定量PCR仪(Version1.4.0)反应结束后，根据PCR仪说明书及荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值。手动调整时，基线（Baseline）的起始点（Start）设定在5~8之间，终止点（Stop）设定在12~15之间，阈值线（Threshold）通常设定在1000~5000之间（视具体情况而定）。设定之后，点击“Analyze”（分析）按键，即可从“Report”窗口的“Ct”处得到各样本的Ct值。10.1.2StratageneMx3000P型荧光定量PCR仪反应结束后，根据荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值，手动调整基线（Non-adaptivebaseline）的起始点（Start）一般设定为5~8，终止点（Stop）一般设定为12~15，阈值线（Thresholdfluorescence）通常设定在500~2000之间（视具体情况而定）。设定之后，可以从“Textreport”窗口的“Ct(dRn)”处得到各样本的Ct值。10.2质量控制10.2.1B-raf阴性质控品C：靶基因通道无S型扩增曲线，Reports界面Ct一栏显示Undetermined；10.2.2B-raf阳性质控品C：靶基因通道有S型扩增曲线，且15≤Ct≤25；以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效；10.2.3待测样品的Ct32时，低于本试剂盒测序检测下限，不能进行后续的测序反应，说明加入的DNA含量不足或含有较多的PCR抑制物，应重新提取DNA或调整DNA加样量，必须使待测样品的Ct≤32，才能满足后续实验要求；10.2.4若检测靶基因通道无S型扩增曲线，Reports界面Ct一栏显示Undetermined，则样本提取无DNA，为阴性，建议重新提取；10.3反应完毕，存储PCR结果以便进行数据分析，PCR产物用于后续实验。11、PCR产物的酶解对样本DNA含量(Ct≤32)PCR产物和B-raf阳性质控品C分别取5μL于PCR反应管中，再分别加入2µLSAP酶混合液涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒，于PCR仪上进行酶解。酶解程序如下：37℃60分钟，80℃15分钟。12、基因分析PCR反应分别取样本和B-raf阳性质控品C酶解产物3µL、测序试剂1µL和B-raf测序引物2µL进行PCR扩增，具体条件。序号阶段温度时间循环数1预变性96℃1分钟12变性96℃10秒253退火50℃5秒4延伸60℃2分钟5仪器冷却25℃1分钟113、基因分析产物纯化0.2ml离心管中13.1.在每孔内加入16µL醋酸钠-乙醇混合物(3MNaAc:无水乙醇=1:15)，剧烈振荡，避光静置15分钟12000g以上4℃离心30分钟，吸弃上层液体；13.2.加入70µL70%预冷乙醇，剧烈振荡，12000g以上4℃离心15分钟，吸取上层液体；13.3.让酒精在室温挥发干净，加入12µLHi-DiFormamide溶解DNA；13.4.在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟，上机电泳；在自动化的基因分析仪上进行分析，若不能当日基因分析，可置-20℃保存。14、检测结果分析采用测序分析软件Chromas对结果进行分析：14.1.用Chromas软件打开测序结果，在Edit菜单下点击“Reverse+Complement”；14.2.删除不稳定测序区域；14.3.在Find下，找到序列GGAGCT，移动光标至“G”左侧的第一个碱基，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域，在Edit菜单下点击“DeleteCutoffSequences”删除以上区域；14.4.按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，将其后面的序列与下面的野生型标准序列比对，标记处600(T1799A)位密码子GTG可能会发生T→A的突变（参考突变判读依据）。野生型核苷酸TTTGGTCTAGCTACAGTGAAATCT野生型氨基酸FGLATVKS突变型核苷酸TTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCT突变型氨基酸FGLATEKS突变判读依据：杂合峰：如果在一个特定的位点上出现了两种颜色的峰叠在一起即为杂合峰。在毛细管电泳时，这些测序图的峰高代表荧光强度，一种荧光素的高度能在一定程度上代表某一特定片段的量。临床取得的肿瘤组织一般会携带正常细胞和肿瘤细胞，因此得到的测序结果中往往会存在2种颜色的峰同时存在。判读结果时根据突变的热点区、噪音的高低以及污染的轻重来综合判断，当杂合峰的高度显著高于其左右周边的噪音时，可判读为存在突变型。按上述方法查找突变位点，并将结果记录在报告上，若没出现则可能前面的序列发生了移码突变、插入碱基等情形,需要对照标准序列将测序序列校正后返回本步骤重新分析。15、注意事项15.1.请自备石蜡切片DNA提取试剂盒，移液器，振荡器，离心机，无菌带滤芯吸头、离心管、PCR反应管、测序板、无水乙醇、醋酸钠及无粉一次性乳胶手套(经常更换)15.2.使用本产品时，应遵循临床基因扩增实验室的技术规范进行操作。临床基因扩增实验室应该分为以下三个区域、并且各个区域应具有以下表格中的必备物品：PCR准备区-PCR反应体系配制区；样本处理区-样本处理、加样区；检测区-PCR扩增、荧光检测、结果分析区。各区的仪器、耗材、试剂等独立专用，各区间人员流动及空气流动应有严格要求，最大限度避免交叉污染。本产品涉及到PCR产物的开盖操做，实验过程要特别注意，酶解、测序反应和测序产物纯化只能在检测区进行，严禁在PCR准备区和样本处理区进行。16、参考文献[1]NikiforovaMN,KimuraET,GandhiM,BiddingerPW,KnaufJA,Baso