搜索
第五章.分子生物学研究方法第一节基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose&Polyacrylamide)•将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。•在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。•在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。•DNA的脉冲电场电泳技术:PFGE-Pulse-fieldgelelectrophoresis2．核酸的分子杂交技术在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleicacidblotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dotandslotblotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。3．细菌的转化所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；DNA聚合酶常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性。②该酶能够用2'，3'--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3'-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图b．DNA序列分析自动化(分析反应\读片过程)用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。DNA测序的全过程(实际)5．基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。如：盒式诱变(cassettemutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.a.凝胶滞缓实验(Gelretardationassay)，又称DNA迁移率变化试验(DNAmobilityshiftassay--EMSA)。b．DNaseI印迹试验（DNaseIfootprinting）•主要步骤：①用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；②加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；③加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；⑤进行DNA凝胶分析。•如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。7.PCR技术（基因的体外扩增法）•(1).概念PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n个新生的DNA分子。特别注意：(2).一个PCR体系的基本组成•超纯水•缓冲液•Mg2+•dNTPs•DNA模板•引物•TaqDNA聚合酶(3).PCR(聚合酶链式反应)基本原理(4).PCR的主要步骤•①.高温变性在高温（93-95℃）下，待扩增的双链DNA模板受热变性成为两条单链DNA模板。•②.低温退火在低温（37～60℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链。•③.适温延伸在TaqDNA聚合酶的最适温度（72℃）下，以引物3’-OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料，按5’→3’方向延伸,合成单链DNA模板的互补链。(5).PCR的主要步骤小结每一双链DNA模板，经过一轮变性（解链）、退火、延伸3个步骤的热循环后就成了两个双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所得到的双链DNA（PCR产物）均能成为下一次循环的模板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使DNA模板扩增到109倍以上，实际上一般可达106～107倍。生物技术工程•基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程重组DNA技术发展史上的重大事件•1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。•1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。•1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质是DNA。•1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。•1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。•1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。•1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。•50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。•1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于1972年获得第一个重组DNA分子，1973年Cohen第一例成功的克隆实验：完成第一例细菌基因克隆。•1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。•1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。•1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物•1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。•1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。•1982美、英批准使用第一例基因工程药物—重组人胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。•1983获得第一例转基因植物。•1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。•1985出现第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼•1988J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。•1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--“Oncomouse”。•1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)•1993-1994第一批基因工程西红柿在美国上市。•1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。•1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。•1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%•2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图•2001.2.11公布人类基因组基本信息基因工程中常见的名词:①遗传工程--geneticengineering，②基因操作--gonemanipulation，③基因克隆--gonecloning④重组DNA技术--recombinantDNAtechnology⑤分子克隆--molecularcloning。一、基因工程概述1.概念基因工程：是指将外源基因经过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。第二节基因工程2.基因工程的基本程序及技术特点：①基本程序：分—切—接—转—筛基因工程的基本程序•②技术特点：1.可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因重组、表达、测序、诱变、修复；2.方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。3.基因工程的主要技术•DNA、RNA的分离纯化•凝胶电泳技术•PCR技术•DNA合成技术•DNA重组•微生物的培养、保存•酶切•鉴定•DNA测序•分子杂交•4.1概念4.基因克隆克隆的概念⑴在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。⑵在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。⑶在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过程。亚克隆的概念•是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。基因克隆是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。4.2基因克隆示意图载体DNA(限制性内切酶切开)目的基因＋宿主细胞＋重组体已转化的宿主细胞阳性克隆株繁殖表达二.基因工程的要素及实施（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADNA连接酶通过生成3′,5′-磷酸二酯键,把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶Ⅰ探针标记、从3′-OH端补平双链ＤＮＡ中的缺口反转录酶以RNA链为模板，进行cDNA合成多核苷酸激酶5′－ＯＨ磷酸化、探针标记末端转移酶在双链核酸的末端3′－ＯＨ加上多聚单核苷酸碱性磷酸酶切除5′末端磷酸基1.常用的工具酶的功能：酶类名称功能阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年度诺贝尔生理学和医学奖.2.一把特殊的剪刀——限制性内切酶的发现3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的分类、作用及命名•作用：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键•分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型•命名（举例）EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)3.限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)的识别和切割•识别和切割位点：–回文结构4～6bp–出现两种末端：*粘性末端（粘端）*平头末端（平端）产生了平头末端产生了粘性末端粘性末端与平头末端EcoRⅠGAATTCCTTAAG5′3′5′3′5′GCTTAAAATTCG3′3′5′粘性末端SmaⅠCCCGGGGGGCCC5′3′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′平头末端4