酶的分离纯化

酶的分离纯化摘要：本文概述了在实验中由于酶浓度、饱和度等不同条件下对酶进行分离纯化的适用方法。酶的分离纯化有很多种方法，在纯化的工艺上有很大的不同，不同来源的酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。关键词：酶；分离；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。酶的纯化过程在目前来说仍是一门实验科学。一个特定酶的提纯往往需要经过多个实验的探索才能总结出一般经验规律。酶的分离纯化又与其他蛋白质的纯化过程存在很大的差异，酶的分离纯化有其自己独有的特点：一是特定酶在细胞中的含量少，二是酶通过测定活力的方法可以加以跟踪，前者给实验带来困难，后者为实验提供了捷径。正文：1.酶的分离与纯化的概念[1]酶的分离与纯化是指将酶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程。酶分离纯化的一般原则：①防止酶变性失活1．）酶纯化一般在低温条件下进行（0~4℃）2.）各种溶液应该用缓冲液，PH应调到使酶最稳定的PH3.）各种溶液中还可以加入酶保护剂②建立一个可靠和快速的测活方法方法专一、灵敏、精确、简便、经济③酶原料的选取选择目的酶含量丰富的原料，且要考虑取材方便、经济节约等因素2.酶的分离纯化2.1细胞破碎[2]各种生物组织的细胞具有不同的特点，在采用破碎方法时，要根据细胞的性质，酶的性质来选取合适的破碎方法。1.）机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。研磨法：用研钵直接研磨。常用于微生物的微生物材料的破碎。匀浆法：利用高压匀浆泵、玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机将细胞破碎。常用于动植物细胞的破碎。2.）物理破碎通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。温度差破碎法应用在脆弱易破的细胞上效果显著。压力差破碎法：通过压力的突然变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法。渗透压法，渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。超声波破碎法：超声波破碎是利用超声波振荡器发射的超声波处理细胞悬浮液。一般认为在超声波作用下液体发生空化作用，液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性漩涡在细胞上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。超声波破碎适用于很多微生物的破碎。3.)化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使得细胞膜的结构改变和破坏，从而破碎细胞。常用有机溶剂，如甲苯、丙酮丁醇、氯仿等；表面活性剂：Triton、Tween。4.）酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶试剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到破碎细胞。常用方法有自溶法和外加酶制剂法。在外加酶法中常用的溶酶有溶菌酶（Lysozyme）、β-1,3-葡聚糖酶（Glucanase）、β-1,6葡聚糖酶、蛋白酶（Protease）、甘露糖酶（Mannanase）、糖苷酶（Glycosidase）、肽键内切酶（Endopeptidase）、壳多糖酶等。5.)冻融法生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。冻融法所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、络合剂EDTA、还原剂DTT(二硫苏糖醇)等以防破坏目的酶。6.)干燥法通过干燥是细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。如气流干燥、喷雾干燥、真空干燥等等方法。3.2酶的提取[3]把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。抽提条件的选择：一般用稀盐、稀酸、稀碱的水溶液进行抽提。主要提取方法[4]：1.）盐溶液提取大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而酶浓度不能太高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02~0.5mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的α－淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol/L的氯化钠溶液或0.02~0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5~0.6mol/L的磷酸氢二钠溶液提取；6－磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取：枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。如：采用（NH4）2SO4分段盐析、透析、阴离子交换柱层析[5]2.)酸溶液提取有的酶在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好，宜用酸溶液提取。例如从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12mol/L的硫酸溶液进行提取。3.）碱溶液提取有的酶在碱溶液中溶解度大，且稳定性较好，宜用碱溶液提取。例如，细菌L－天门冬酰胺酶的提取是将含酶菌体悬浮在pH11~12.5的碱溶液中，振荡20min，即达到显著的提取效果。4.)有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、胆碱酯酶等的提取。如：豆壳氧化物酶液经硫酸铵-丙酮协同沉淀，丙酮分级沉淀，最后用硫酸锌除杂[6]。3.2酶分离纯化的方法的选择[7]工作前应对要分离纯化的酶的理化性质（溶解度、分子大小和解离特性等）以及酶的稳定性等有一个较为全面的了解。根据溶解度大小不同建立的分离方法有：盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法、共沉淀法、PEG沉淀法、等电点沉淀法等。根据分子大小差异建立的分离方法有：凝胶过滤法、超过滤法、离心法、超离心法、根据电学、解离特性差异建立的分离方法有：吸附法、离子交换法、电泳法（区带、等电聚焦）、聚焦层析、疏水层析、高压层析（HPLC）等。根据稳定性差异建立的分离方法有：选择性热变性、选择性酸碱变性、选择性表面变性。根据特殊集团差异建立的分离方法：亲和层析。根据分子所带电荷正负及多少的差异建立的分离方法：离子交换层析法、电泳分离法、聚集层析法等，如：运用离子层析技术对酶分离纯化；运用电泳等技术研究理化特性[9]。3.3酶的干燥、浓缩和结晶浓缩：离心、过滤和膜分离、沉淀、层析等都能起到浓缩作用，用各种吸水剂，也能达到浓缩的效果。通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。干燥：为便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥。结晶：结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。不仅为酶的结构、功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高的纯度的酶的获得和和应用创造了条件。酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的程度。常用的结晶方法有：盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平衡结晶、等电点结晶、气象扩散法、PH诱导法、温度诱导法等。3.4酶纯度的检查常用方法：超离心法、凝胶色谱法、SDS-PAGE、离子交换色谱、自由电泳、区带电泳、等电聚焦、聚焦色谱等。目前广泛采用的是电泳，从电泳分析的结果可判断试样中是否存在杂质，并选择有针对性的分离方法对试样进行进一步的纯化处理。3.5酶纯化步骤的定量评价一、酶活力(Enzymeactivity)酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量1961年国际酶学会规定lmin催化lμmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位(国际单位)，温度为25℃，其它条件(pH、离子强度)采用最适条件。二、比活力比活力是在一定条件下样品中每毫克蛋白质（包括非目的酶蛋白、非酶蛋白、变性酶蛋白和目的酶蛋白）所含酶的活力单位数。U/mg蛋白质或U/mg氮。3.5影响酶分离纯化的因素在显微镜下，可观察到凝胶过滤层析介质具有海绵状结构。将凝胶装于层析柱中，加入混合液，内含不同分子量的物质[12]，小分子溶质能在凝胶海绵状网格内，即凝胶内部空间全都能为小分子溶质所达到，凝胶内外小分子溶质浓度一致。在向下移动的过程中，它从一个凝胶颗粒内部扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进人与流出，使流程增长，移动速率慢故最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分送入凝胶颗粒，从而在大分子与小分子物质之间被洗脱。大分子溶质不能透人凝胶内，而只能沿着凝胶颗粒间隙流运动，因此流程短，下移速度较小分子溶质快而首先流出层析柱。因而样品通过定距离的层析柱后，不同大小的分子将按先后顺序依次流出，彼此分开。图凝胶过滤层析的原理小分子由于扩散作用进入凝胶内部被截留；大分子被排阻在颗粒外，在颗粒间迅速通过。(1)蛋白质混合物上柱(2)洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内大分子被排阻在颗粒外(3)小分子被截留，大分子向下移动，大小分子分开(4)大小分子完全分开(5)大分子行程较短，已洗脱出层析柱,小分子尚在行进中4酶的分离纯化新技术在生产中的应用4.1三种方法（1）组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶（2）微生物发酵：最大量的来源（3）化学及生物合成：生物重组4.2高新技术的应用：(1)酶的修饰(2)固定化(3)基因重组(4)膜分离技术(5)冷冻干燥(6)微胶囊总结：21世纪，生物科学与生物工程的发展将进一步揭示生命的奥秘在世界科技和经济发展中起主导和支柱作用。作为生物工程重要组成部分的酶工程亦将飞速发展，前景广阔。酶制剂的品种、规模不断扩大，目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。酶的应用领域也不断在扩大，美国酶制剂年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。酶制剂的生产不仅看数量，更要看质量。酶是否可用关键在于酶的分离纯化，因此我们应该好好掌握酶的分离纯化的要领。参考文献：[1]郭勇.酶工程.第2版.北京：科学出版社，2004.[2]罗贵民.酶工程.北京:化学工业出版社,2002.[3]徐凤彩.酶工程.北京：中国农业出版社，2001.[4]施巧琴.酶工程.北京:科学出版社,2005.[5]康平.汪秋宽.宋琳琳.徐玲.皱纹盘鲍内脏酶的酶学性质及褐藻胶裂解酶的分离纯化.水产学报[J].2007,31(1).[6]刘均洪,邱龙辉,李俊峰,刘全兰,王繁业,吴汝林.豆壳过氧化物的分离纯化新工艺研究[J].化学工程,2005,33(6).[7]周晓云.酶学原理与酶工程.北京:中国情工业出版社,2005.