质粒DNA的小量提取

实验四质粒DNA的小量提取一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColEⅠ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去垢剂(SDS)处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中，用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（opencircularDNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的1.掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。2.了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌E.coli,含pGEX-4T-2质粒试剂：1.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，用NaOH调pH至7.3左右，如固体培养基则添加15g/L琼脂。2.ResuspentionBuffer3.LysisBuffer4.NeutralizationBuffer5.Washbuffer6.ElutionBuffer7.SpinColomuns仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、离心机、1.5ml离心管、移液枪、吸头四、实验步骤1.将1~1.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。2.于10000rpm离心30秒，并弃去上清液。如有需要，可多次重复步骤1、2以手机更多细菌菌体。但勿过量，以免影响提取质粒的质量。3.加250ulResuspensionBuffer，重悬细菌体沉淀。4.加250ul细菌Lysisbuffer,轻柔颠倒4~6次。不要剧烈振动，以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。5.加350ulNeutralizationbuffer，立即轻柔颠倒离心管4~6次。溶液应该出现絮状物，但不会出现局部沉淀。6.于13000rpm离心10分钟。如离心机转速不够可延长离心时间，直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolomun内，于6000rpm离心1分钟，并弃去接液管内液体。8.向Spincolumn内加650ulwashbuffer,于12000离心1分钟，并弃去接液管内液体。9.重复第8步一次。10.再次于12000g离心1分钟，然后将Spincolomn转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残夜被彻底清除。11.向Spincolomn内加入50ulElutionbuffer,去离子水或TE溶液，并于室温静置1分钟。可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。12.于12000g离心1分钟，1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。五、注意1.在洗脱前将Elutionbuffer于30-60度温育，可提高提取效率。2.收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液汇总充分悬浮。六、思考题1.裂解细菌时需注意的事项有哪些？2.质粒的基本性质有哪些？3.如何提高质粒DNA的产量？4.为什么质粒DNA不能反复在4度、-20度、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？