清醒动物脑部微透析操作流程

深圳市瑞沃德生命科技有限公司1清醒动物脑部微透析操作流程一、微透析技术基本原理微透析技术是一种在体微量化学采样与检测技术，由西班牙之Delgado及瑞典之Ungerstedt等人于1972年自更早的压抽导管（push-pullcannula）改进而来。其基本的原理（如右图所示）：选择具有一定截留分子量的纤维半透膜制成的探针埋入待测的组织区域，以恒定速度向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液，当灌流液流经探头前端透析膜时，组织内小分子量生物活性物质即顺浓度梯度从膜外扩散入膜内，并随灌流液被引流至探针外，按一定的时间间隔连续收集透析液，检测其中待测生物活性物质水平，可监测该区域内细胞外生物活性物质浓度的经时变化过程。二、实验材料1.麻醉、定位手术：异氟烷麻醉系统（含麻醉空气泵、麻醉机、脑立体定位/回收面罩、麻醉诱导盒、异氟烷）、废气回收系统（含活性碳过滤罐、气体回收器或气体回收泵）、颅钻（含钻头）、冷光源、显微镜、体温维持仪、脑部微透析或微注射动物手术器械包（主要含#3号手术刀柄、11#手术刀片、手术剪、精细剪、撑开器、组织镊、三角缝针、缝线、止血钳、微型凝血器、十字小螺丝刀、灭菌盒、动物剃毛器、碘伏、酒精棉球、无菌干棉球、）2.微透析：微透析泵、1-5mL规格注射器、探针及配件（导管、导管帽、锁紧螺帽、探针夹持器、导管定位适配器）、低温冷冻收集器、样品收集管、连接管路、管路接头、清醒活动装置（含动物活动笼）、牙科水泥（含牙托粉和牙托水）、灌流液3.个人防护：一次性乳胶手套、实验服、鞋套、口罩、帽子三、操作步骤1、动物准备（1）动物麻醉与固定：①将脑立体定位/回收面罩安装于动物适配器上，面罩入口与出口分别连接麻醉系统和废气回收系统，如下图2所示；②快速诱导麻醉：手提动物尾根部，将动物放入麻醉诱导盒，打开麻醉系统（氧气流量调节：大鼠一般为500-700ml/min，小鼠一般深圳市瑞沃德生命科技有限公司2为300-500ml/min，异氟烷浓度调为4-5%），通入异氟烷麻醉气体，一般5min左右，动物即进入深度麻醉状态（可通过动物的呼吸、眼角反射、摇晃诱导盒综合判断动物的状态）；（2）动物固定：将麻醉气体转换开关通向脑立体定位/回收面罩，调节异氟烷维持麻醉浓度（大鼠一般2-2.5%，小鼠一般为1-1.5%），从诱导盒取出动物，通过“固定门齿、压鼻梁、左右耳道插入耳杆”三部位固定动物头部；固定时，务必使动物头部处于水平状态（具体操作详见第（5）步）；（3）备皮：①用剃毛器将头部手术部位及周边部位的毛发剔除干净；②依次用碘伏、酒精棉球消毒；（4）暴露颅骨：①用手术刀片沿颅面中线切开头皮，切口长度约1cm，剔除颅骨表面的软结缔组织，再用无菌干棉球轻轻擦拭颅骨表面，即可清晰地看到前囟（Bregma）部位的十字缝线和后囟（Lambda）部位的人字缝线；（5）定位调节：此步骤对于精确将探针定位到目标核团非常重要，可通过几个操作确定，①首先，保证动物的鼻尖与适配器的中心线在一条直线上；②夹持一根注射针，针尖刚好接触前囟点，然后以此点为标准，依次沿前囟→后囟的方向移动，在中间和后囟再取两个点，观察针尖是否也刚好接触这两个点，否则需调节适配器的高度；③左、右耳杆高度应一致、位置需对称保持平衡；④用拇指和食指轻捏动物左右额面，摇晃头部，看是否晃动，否则需调节鼻杆固定；（6）定位钻孔：①参考脑立体定位图谱，精确找准目标核团（比如海马）水平方向的X、Y坐标点（AP值和ML值），此点即为导管或探针植入的点；②钻孔：选择与导管的杆外径尺寸近似的钻头（比如导管的杆外径为0.6mm，则可以选择0.8mm直径的钻头）；同时，需另外钻两个孔安置固定螺丝（同样，需选择与螺丝直径尺寸近似的钻头，比如螺丝直径为1mm，则钻头可以选择0.8mm），深圳市瑞沃德生命科技有限公司3这两个孔的位置与植入导管的孔一般成正三角形（如下图3所示），此步操作的目的是增加导管基座与颅骨的粘合力，使导管不容易脱落。值得注意的是：钻孔时，双手垂直握住颅钻手柄或通过颅钻夹持器固定手柄，切忌用力过大，因为大小鼠颅骨均很薄，约0.5mm左右，用力过大很容易伤到脑组织，且会大量出血；缓慢用力，当孔转开时，有很强的落空感，此时应停止向下用力，可调整钻头旋转方向，对孔的边缘做适当休整。2、植入探针（1）植入螺丝：选择规格合适的小螺丝，用十字螺丝刀将螺丝固定于颅骨里（如图4所示）；（2）植入导管：导管植入前，使用注射器的尖头刺破脑组织表面的硬脑膜，然后将用导管夹持器夹紧导管头部固定，按计算好的目标核团的Z坐标（DV值）垂直植入导管；（3）牙科水泥固定：骨螺丝和导管均植入完毕后，按适当比例混合牙托粉和牙托水，将骨螺丝和导管一起粘合在颅骨表面，为了确保固定牢固，牙科水泥需添加到导管头上两个孔的高度（如下图5所示）。等待牙科水泥凝固后，方可松开导管夹持器或退出定位器，之后缓慢插入导管帽；（4）伤口缝合：根据伤口和牙科水泥固定的实际情况，缝合皮肤，并在伤口周围可适当涂深圳市瑞沃德生命科技有限公司4抹靑链霉素，防止伤口感染；（5）动物恢复：①上述步骤完成后，解除动物头部固定，关闭麻醉系统和废气回收系统，约5分钟之内，动物即可苏醒；②将手术后的动物单独放于活动笼饲养，可每日注射1次抗菌素，等待动物恢复3-5天后，可进行清醒动物的微透析。3、微透析（1）微透析探针的准备：打开包装后，首先进行探针检测：①准备1mL或者2mL的注射器，装满双蒸水，固定于微透析泵；②用管路接头和管路连接探针的入口与注射器针头；③低速（1-2ul/min）向探针开始注射双蒸水约5-10min，若观察到整个探针膜表面有湿润或“流泪”现象，探针出口无双蒸水流出，这是正常现象，并非探针膜有破损；若观察到探针膜某处成“股”状流出双蒸水，说明探针膜有破损或漏洞，应更换探针；④若前一步骤检测的现象正常，停止注射，将探针浸入双蒸水约5min后，以同样速度重新开始注射几分钟，若观察到探针的出口有双蒸水流出，则证明探针良好，可以继续使用；▲特别注意：①检测时，切忌使用生理盐水、PBS或其它缓冲液进行注射，否则易损坏探针膜；②检测时，切忌错误地将注射器连接探针的出口；③探针正式使用前，须排除气泡：在探针出口不连接任何管路或管路接头时，直接往探针的入口充气，即可排除探针膜内的气泡，否则气泡会导致回收率降低；（2）灌流液的准备：常用非缓冲人工脑脊液（aCSF）或生理盐水作灌流液，其中CSF灌流液配方如下：•140mMNaCl•3.0mMKCl•1.2-3.4mMCaCl2•1.0mMMgCl2•1.2mMNa2HPO4•0.27mMNaH2PO4•7.2mMglucose•pH7.4▲特别注意：①切忌使用PBS缓冲液，容易形成磷酸钙盐导致探针堵塞；②灌流液在使用前，需进行脱气处理，否则容易导致探针膜内充满气泡，降低回收率。（3）连接好微透析泵、注射器、清醒活动装置、样品低温收集器等装置；（4）动物恢复后，将动物放于动物诱导盒，用异氟烷快速诱导麻醉后，取出导管帽，插入准备好的探针，连接好探针的出入口以及用系绳或者马甲固定好动物，即可开始进行透析；（5）灌流速度通常在0.5-5ul/min，一般选择1-2ul/min，流速过低易引起膜表面“固体”物聚集，回收率低；流速过高，膜内外没有充分的平衡时间，同样会导致回收率过低，更值得注意的是，若探针的出口连接的管路过长（大于150cm），高速灌流会导致压力过大，损坏探针膜，因此建议探针出口连接样品收集器的管路长度不超过150cm；（6）开始灌流后，由于各连接部件存在死体积，且需要一定的平衡时间，所以通常选择在30min后的样品，具体采样时间、采集体积、间隔采样时间可根据实验需求而定。深圳市瑞沃德生命科技有限公司54、管路和探针的清洁和保养（1）探针：透析结束后，应立即取出探针，用导管帽插入导管封闭。取出的探针置于双蒸水中，用双蒸水在1-2ul/min的速度下冲洗过夜（保持原管路的连接一起冲洗），充分排尽整个管路及探针中的盐分，然后取下探针，置于新鲜双蒸水中保持湿润状态，于4℃冰箱中保存（目的是防止探针膜收缩）。（2）转环：在上述双蒸水过夜冲洗完成后，再用100%丙酮以1-2ul/min的速度冲洗约1个小时（切忌使用次氯酸冲洗），之后自然晾干，密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。（3）管路：在第（1）步完成后，用次氯酸冲洗约0.5个小时，然后再用双蒸水冲洗约1个小时，清除残留的次氯酸，之后密封其出入口，置于低温条件保存，否则易长菌，导致后续微透析时回收率降低。5、回收率的测定（体外）在aCSF液中加入所要透析的目标物的标准物品（已知浓度），将探针置于此溶液中，在相同灌流速度（Ringer’s液）、相同外界温度的条件下进行透析，收集透析出来的样品，测定目标物的的浓度，从而可得此条件下该探针的相对回收率。▲影响回收率的因素：目标物的特性，如分子量大小、溶解性微透析膜的特性，如材质、孔径、长度（0.5-10mm）灌流速度，一般为0.5-5ul/min，一般在30-60min后开始收集灌流液的化学成分、PH值等……四、注意事项微透析实验与许多实验不同，很多方面取决于操作者的技能水平，特别值得注意的有以下几点：1、埋置探针的位置（AP、ML、DV值）要准确，选择合适的探针膜长，一般来说，在目标部位纵向跨度范围内，膜长选择越长，回收率越高；2、探针操作时，需要特别细心，避免探针膜的损坏，从而延长探针的寿命和使用次数；3、探针使用前的预处理，以及在使用间隔期间的处理、冲洗、浸泡，目的也是延长探针的寿命和使用次数；4、连接管路时，需仔细检查，防止漏液和堵塞，同时也要防止连接管和接头的损坏。深圳市瑞沃德生命科技有限公司产品技术部