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第二十二章维生素组员：李恬静胡梦璐向志凌陈双华张博仁柯西林刘建东汤超班级：10级本科6•第一节概述•第二节维生素B2（核黄素）•第三节维生素B12（钴胺素）•第四节维生素C（坏血酸）第一节概述一．分类与功能二．来源与生产1、分类与功能•定义：维生素是维持机体正常生理功能及细胞内特异代谢反应所必需的一类微量低分子有机化合物．1、分类与功能•共同点：１.他们都是以基本体的形式或能被人体利用的前体形式存在于天然食物中；２.大多数维生素不能在体内合成，也不能大量储存于组织中，所以必须经常由食物供给；３.他们不是构成各种组织的原料，也不能提供能量；1、分类与功能４.虽然每日生理需要量很少，但在调节物质代谢过程中起着十分重要的作用；５.维生素常以辅酶或辅基的形式参与酶的功能；６.不少维生素具有几种结构相近，生物活性相同的化合物。1、分类与功能•分类：脂溶性维生素水溶性维生素•ADEKBC•溶于脂肪有机溶剂溶于水•有前体或前维生素一般无前体•需脂性环境和胆盐帮助才吸收易吸收•吸收入淋巴系统吸收入血液•主要贮存于肝脏中体内没有非功能性的单纯的储存形式•摄取过多时引起中毒摄取过多从尿中排出•摄取过少，缓慢出现缺乏摄取过少时，迅速出现缺乏P447活性状态与生理功能第一节概述一．分类与功能二．来源与生产2、来源与生产•来源：①自食物直接获得②间接从植物获得（即利用植物中的前提物质在体内能转变为维生素）③人工合成或微生物合成2、来源与生产•生产：①化学合成（A）②发酵（B2、B12工业发酵）维生素C是产量最大的维生素，其合成步骤包括化学反应、微生物转化等第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化第二节维生素B2•维生素B2（核黄素）7,8-二甲基-10-（D-1-核糖基）异咯嗪其活性形式黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）是氧化还原的辅酶水溶性维生素，容易消化和吸收，易随尿液排出不会蓄积在体内成人日需量0.3--1.8mg/dP448维生素B2（核黄素）•主要生理功能--合成FMN和FAD，这两种物质都是氧化还原酶的电子受体•分布广泛存在于酵母、肝、肾、青菜、黄豆、蛋、奶等中•缺乏主要表现在唇、舌、口腔黏膜和皮肤会阴处，称为“口腔生殖综合征”•主要生产方法微生物发酵法第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化1、菌种生产菌：•棉病囊霉Ashbyagossypii•阿氏假囊酵母Fremotheciumashbyii•根霉、曲霉、青霉、梭状芽孢杆菌、产气杆菌、大肠杆菌等•最主要生产菌棉病囊霉、阿氏假囊酵母1、菌种棉病囊霉：•是植物致病菌，菌丝发达、有横隔、多核、孢子囊通常生长在菌丝中间，单生或成串，孢子数目通常为2的倍数(如12--16)，位于孢子囊两端成束状排列•成熟的囊细胞与菌丝脱离，孢子从不固定的破裂处散出，孢子呈纺锤形，两端尖，下端有一根尾鞭1、菌种•阿氏假囊酵母•阿氏假囊酵母形态上与棉病囊霉相似，区别为其孢子短而粗、一端尖细弯曲、没有尾鞭、孢子不成熟、排列无一定的次序、菌丝横隔较少、细胞中有黄色素第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化2、工艺路线•维生素B2采用三级发酵a.将在25℃培养成熟的维生素B2产生菌的阿氏假囊酵母斜面孢子用无菌水制成孢子悬浮液。接种到种子培养基中培养，培养温度为（30±1）℃，培养时间为30-40小时；b.将上述种子液移种二级种子罐培养，培养温度（30±1）℃，培养时间为20小时；c.将二级种子液移种到三级发酵罐发酵，发酵温度（30±1）℃，发酵终点时间约为160小时2、工艺路线•阿氏假囊酵母发酵法生产维生素B2工艺路线第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化3、培养基A.保存菌种用培养基葡萄糖2%、蛋白胨0.1%、麦芽浸膏5%、琼脂2%灭菌后用氢氧化钠溶液调PH到6.5A.发酵培养基米糠油4%、玉米浆1.5%、骨胶1.8%、鱼粉1.5%、KH2PO40.1%、NaCl0.2%、CaCl20.1%、(NH4)2SO40.02%补料：米糠油3%、麦芽糖0.5%第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化4、培养基的选择•维生素B2发酵单位的提高依赖于碳源的合理选碳源主要是各种油脂•混合碳源也能提高VB2产量：米糠油及骨胶第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化5、前体及刺激剂•嘌呤类化合物前体对发酵生产维生素B2有刺激作用5、前体及刺激剂•刺激剂还有肌醇、甲硫氨酸等将肌醇与葡萄糖结合起来，并采取办连续滴加方式培养培养，可明显提高发酵单位第二节维生素B2一．菌种二．工艺路线三．培养基四．培养基的选择五．前体及刺激剂六、发酵过程中的代谢曲线变化6、发酵过程中的代谢曲线变化•随着发酵的进行，糖逐渐被利用PH先降后升，发酵到32小时维生素B2才开始生产。碳源：该菌种的最好碳源是工业葡萄糖，也可以用蔗糖和麦芽糖来代替，但不能用利用淀粉、糖蜜和普通的戊糖氮源：玉米浆、动物胶、动物下水、肉渣或蛋白胨酶解的骨胶和脂质以及玉米浆、酒糟和啤酒酵母都可以增加维生素B2的产量棉病囊霉的发酵代谢变化曲线6、发酵过程中的代谢曲线变化阿氏假囊酵母生产B2的发酵曲线第三节维生素B12一．理化性质二．发酵生产三．分离提取第三节维生素B12•维生素B12又称钴胺素(cobalamin)、氰钴胺素（cyanocobalamin）、动物蛋白因子(animalproteinfactor)。是一种预防和治疗由于内因子缺乏以致吸收障碍而引起恶性贫血的维生素。•来源：肝、鱼粉、蛋、乳、黄豆、某些放线菌及霉菌的菌丝体和土壤污泥中、某些藻类及豆科植物•功能：维生素B12的主要生理功能是参与制造骨髓红细胞，防止恶性贫血；防止大脑神经受到破坏。维生素B12化学结构维生素B12是一系列含有以钴原子为中心的咕啉核和以5，6-二甲基苯基咪唑为碱基的核苷酸并对人和动物具有生物活性的类咕啉同功能维生素的总称第三节维生素B12一．理化性质二．发酵生产三．分离提取1、理化性质•深红色结晶体，熔点高(320℃时不熔)，无臭无味，溶于水、乙醇和丙酮，不溶于氯仿、丙酮和乙醚；•结构性质相当稳定；•在中性溶液中•耐热、酸、碱，日光、•氧化剂和还原剂均能使其破坏。第三节维生素B12一．理化性质二．发酵生产三．分离提取2、发酵生产①菌种•放线菌、细菌（一般也能生产）•酵母、霉菌（很少生产）•脱氮假单胞菌、傅氏丙酸杆菌及薛氏丙酸菌是目前工业应用最广的维生素B12生产菌2、发酵生产①菌种•生产维生素B12的各种微生物及其产率优于链霉菌和其他菌种，可进行自然选育和诱变筛选，提高产率2、发酵生产②培养基•目的：增加产量•1.碳源与氮源碳源：对于傅氏丙酸杆菌葡萄糖对其生长较好，而乳糖使维生素B12的产量较高。其他可利用的碳源是甜菜糖蜜、转化糖和麦芽糖。一般使培养基中糖的含量维持在1%-2%氮源：可以用玉米浆、豆饼粉、酵母提取物或水解物、麦芽提取物．青霉索发酵菌丝、酱油渣或铵盐、硫酸铵、氢氧化铵、乳清、玉米浸汁等2、发酵生产②培养基2.无机盐微量铁、镁、锰盐等。镁离子对维生素B12的合成是必须的，在50-100mg/L时产量最高；银离子在0.26-0.65mg/L浓度时促进维生素B12的产生；铬离子抑制维生素B12的产生；锌离子对维生素B12的产生无影响；钴对微生物一般看做是有毒的，如10-20mg/LCo2+抑制链丝菌的生长，在较低浓度(1-2mg/L)Co2+可提高维生素B12的产量2、发酵生产②培养基•3.前体由于维生素B12的结构已经清楚，发酵时可加前体以增加其产量。在傅氏丙酸菌发酵液中添加氰化亚铜35—50mg/L可增加氰钻胺素产量。如加氰化铜更好，此物质可加到较高浓度而不引起毒性．5，6-二甲基苯并咪唑是构成维生素B12分子上的核苷基的碱基，加入培养基中可使维生素B12产量增加，一般在发酵后期加。另一前体是δ-氨基-γ-酮基戊酸(δ-aminolacvulinicacid)．该化合物是合成类卟啉基本结构的物质。直接添加效果不明显，加δ-氨基-γ-酮基戊酸的前体甘氨酸的效果更好。在发酵培养基中加0.2%的甘氮酸，发酵6天后，维生素B12比对照提高75%2、发酵生产②培养基•不同发酵培养基的维生素B12产量2、发酵生产③发酵•脱氮假单胞菌、傅氏丙酸杆菌及薛氏丙酸菌是目前工业应用最广的维生素B12生产菌（其中丙酸菌是兼性厌氧菌）•以谢氏丙酸菌发酵生产维生素B12为例，由于其本身能产生5.6-二甲苯并咪唑，故不需要在发酵中加入。已知通气有利于5，6-_二甲苯并咪唑的合成，因此在使用该类菌株时采用两阶段发酵法：2、发酵生产③发酵•两阶段发酵法：第一阶段：一般是在不通气条件下进行，以促使细菌的生长和钴啉醇酰胺的合成，第一阶段碳源基本耗尽，生长的最适温度是37℃；第二阶段：通气培养使5，6-二甲苯并咪唑得以迅速合成并将钴啉醇胺转化为腺苷钴胺，合成维生素B12最适温度是30℃。可在前期37℃培养2天让细菌生长繁殖，然后再30℃发酵。但一般在实际工作中全过程都在30℃进行。培养基含糖量应维持在l%左右，所以需中间补糖，pH维持在6.8—7.0。发酵过程由于不断产生丙酸和少量乙酸及CO2，培养基pH不断下降，影响目的产物的生物合成，所以要不断加氨维持pH。也可用Na2C03或CaCO3中和2、发酵生产③发酵1.工艺路线谢氏丙酸杆菌中试规模发酵生产维生素B12的工艺图2、发酵生产③发酵•2.工艺过程•(l)斜面种子培养：取脱脂牛奶冷冻管保藏的谢氏丙酸杆菌，接种于斜面培养基上，30℃培养4天．斜面培养基组成为：每1L含胰蛋白胨10g、酵母提取物10g、过滤西红柿汁200ml、琼脂15g，pH7.27•(2)一级种子培养：取2L摇瓶，装一级种子培养基0.4L，接种斜面培养基培养的菌苔.30℃静止培养2天。一级种子培养基组成为：每1lL含胰蛋白胨10g、酵母提取物10g、过滤西红柿汁200ml，pH7.22、发酵生产③发酵•(3)二级种子培养：30L不锈钢发酵罐中装二级种子培养基10L，接种一级种子0.3L，30℃不通气培养24小时（用NH4OH维持在pH6.5）。二级种子培养基组成为：每1L含玉米浆20g、葡萄糖90g，调pH6.5•(4)发酵培养：500L发酵罐中装发酵培养基349L，120℃灭菌40分钟，接种二级种子7L，在不通气、微氮气压力和慢搅拌下30℃培养80小时，再在搅拌和2m3/h通气下培养88小时。整个发酵过程用NH4OH维持在pH6.5。发酵培养的组成为：每1L含玉米浆40g、葡萄糖100g(分开灭菌).CoCl220mg，调节pH6.5。2、发酵生产③发酵•发酵过程中，用中空纤维微过滤器过滤发酵液，除去丙酸杆菌在生物合成维生素B12时产生的抑制敛生物生长的丙酸，达到高密度细胞培养，可使维生素B12的产量提高近90%。第三节维生素B12一．理化性质二．发酵生产三．分离提取3、提取分离①自工业废液中提取•生产抗生素、酒精、丙酮、丁醇、造纸、乳制品、枸橼酸处理后的废液等都是生产维生素B12的原料。生产上一般是利用抗生素工业废液，绝大多数是从链霉菌废液中提取。3、提取分离①自工业废液中提取•庆大霉素产生菌发酵液中维生素B12含量亦较高3、提取分离②自微生物细胞中提取•丙酸菌发酵产生的各种钴胺素差不多都存在于细胞内，由于该菌无毒，经过滤或高速离心分离得到菌体后，可直接用作家畜和家禽的饲料添加剂。如用于临床，须进一步分离提取和精制。下面以薛氏丙酸杆菌发酵生产维生素B12为例，介绍自发酵的微生物细胞中提取维生素B12的工艺3、提取分离②自微生物细胞中提取•1.工艺路线薛氏丙酸杆菌细胞中提取维生素