BCA-蛋白定量中文说明thermo

说明书Pierce®BCAProteinAssayKit（Pierce®BCA蛋白定量分析试剂盒）NCI3225CHNCI3227CH2436.0目录号描述NCI3225CHPierceBCAProteinAssayKit（PierceBCA蛋白定量分析试剂盒），试剂可用于500次试管或5000次微孔板分析NCI3227CHPierceBCAProteinAssayKit（PierceBCA蛋白定量分析试剂盒），试剂可用于250次试管或2500次微孔板分析试剂盒组分：BCA试剂A，1000mL（产品目录号NCI3225CH）或500mL（产品目录号NCI3225CH)。含有溶解于0.1M氢氧化钠中的碳酸钠、碳酸氢钠、二喹啉甲酸（BCA）以及酒石酸钠。BCA试剂B，25mL，含有4%的硫酸铜白蛋白标准品，2mg/mL，101mL安瓿，包含浓度为2mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）和0.05%的叠氮化钠，溶解于0.9%生理盐水中。储存：在收到试剂盒后将其储存于室温。常温运输。注：如果在寒冷天气进行运输，或在保存期间，试剂A或试剂B发生沉淀，可通过对溶液进行温和加热和搅拌，将沉淀溶解。当试剂盒发生变色，或证明有微生物污染时，请将试剂丢弃。目录产品简介.....................................................................................................................................................................................2标准品和工作液的制备（两种检测方案均适用）..................................................................................................................3试管检测方案（样品与工作液的比例=1:20）........................................................................................................................4微孔板检测方案（样品与工作液的比例=1:8）......................................................................................................................6常见问题及解决方案.................................................................................................................................................................7ThermoScientific相关产品........................................................................................................................................................8附加信息.....................................................................................................................................................................................9参考文献.....................................................................................................................................................................................11产品简介ThermoScientificPierceBCA蛋白定量分析试剂盒是一种基于二喹啉甲酸（BCA），利用比色法测定总蛋白浓度的蛋白定量试剂盒，可与去污剂兼容。本方法将双缩脲反应和显色反应结合在一起：前者为在碱性介质中，蛋白质可将Cu2+还原成Cu1+的反应，后者为使用含有二喹啉甲酸（BCA）1的独特试剂，利用比色法检测Cu1+，具有高灵敏度和高选择性的特点。此检测方法中产生的紫色显色物质是由两分子的BCA和一分子的亚铜离子螯合而形成的。该水溶性复合物在562nm处具有很强的吸光值，在很宽的蛋白质浓度范围（20-2000g/mL）内，吸光值和蛋白质浓度具有良好的线性关系。BCA法并不是真正的终点检测，实验中颜色将会持续变化。但是，在孵育结束后，颜色继续变化的速率非常慢，足以同时检测大量的样品。据报道，蛋白质的大分子结构、肽键的数量以及四种特定氨基酸（半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸和酪氨酸）的存在与BCA产生颜色反应相关2。对二肽、三肽和四肽的研究表明，整体蛋白产生颜色的强度要高于单个显色基团所产生的颜色的简单加和2。因此，一般采用常见蛋白质诸如牛血清白蛋白（BSA）作为参照标准品，来确定目标蛋白质的浓度。首先，需要制备经过梯度稀释的、浓度已知的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质一起检测，根据绘制出的标准曲线对每个未知浓度的样品进行蛋白浓度的计算。如果要求对未知蛋白浓度进行精确的定量分析，则建议选择一个与未知蛋白质的特性相类似的蛋白质标准品；例如，在分析免疫球蛋白样品时，可以使用牛γ球蛋白（BGG）作为标准品（参见“ThermoScientific相关产品”章节）。本手册介绍了两种检测方案。在这两种方案中，试管检测方案要求蛋白质样品的体积较大（0.1mL）；但是，由于该方案中使用的样品与工作液之间的比例为1:20（v/v），因此最大程度地降低了干扰物质的影响。微孔板方案操作样品更加方便，且需要的蛋白样品的体积较小（10-25L），但是，由于所使用的样品与工作液之间的比例为1:8（v/v），因此该方法与试管法相比，在克服干扰物质对测定结果的影响方面灵活度低、且检测浓度较低的蛋白样品不如试管法灵敏。瓶号A稀释液的体积(L)0B125C325D175E325F325G325H400I400瓶号A稀释液的体积(L)700B400C450D400E400F400标准品和工作液的制备（两种检测方案均适用）A.梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品按照表1制备一组蛋白质标准品。将一安瓿的牛血清白蛋白标准品（BSA）稀释到几个干净的小瓶中，最好使用与待测样品相同的稀释液。每一个1mL安瓿的2mg/mL牛血清白蛋白标准品足够用于制备表1中所列出的任意一组稀释范围的标准品；每个稀释浓度的标准品的体积足够用于3次重复检测。表1.系列稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品用于标准方案的稀释方法（检测范围=20-2,000g/mL）BSA的体积和来源(L)BSA终浓度(g/mL)300L原液2000375L原液1500325L原液1000175LB瓶稀释液750325LC瓶稀释液500325LE瓶稀释液250325LF瓶稀释液125100LG瓶稀释液2500=空白用于试管增强方案的稀释方法（检测范围=5–250g/mL）BSA的体积和来源(L)BSA终浓度(g/mL)100L原液250400L瓶A稀释液125300L瓶B稀释液50400L瓶C稀释液25100L瓶D稀释液500=空白B.制备BCA工作液（WR）1.使用下述公式来确定所需的工作液的总体积：(标准品的个数+待测蛋白质样品的个数)(实验重复次数)(用于每个样品的工作液的体积)=所需的工作液总体积举例：在标准试管检测方案下，检测三个待测蛋白质样品，且每个样品进行两次重复实验：(9个标准品+3个待测蛋白质样品)(2次重复实验)(2mL)=48mL工作液注：在试管方案中，每个样品需要2.0mL的工作液，而在微孔板方案中，每个样品仅需要200µl工作液。2.将50份BCA试剂A与1份BCA试剂B混合（试剂A与试剂B的比率=50:1），制备工作液。上述示例中，将50mL试剂A和1mL试剂B混合即可。注：当试剂B加入到试剂A中时，开始可观察到有浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作液。根据所要分析的样品数量，配制足够体积的工作液。工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数天。实验方案小结（标准试管方案）试管方案（样品与工作液的比例=1:20）1.取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各0.1mL，加入到做好标记的试管中。2.在每个试管中加入2.0mL工作液，充分混合。将试管密封，根据不同实验方案，选择相应温度和时间进行孵育：标准方案：37°C，30分钟（检测范围=20-2000g/mL）室温方案：室温，2小时（检测范围=20-2000g/mL）增强方案：60°C，30分钟（检测范围=5-250g/mL）注：延长孵育时间或升高温度将会增加单次检测在562nm处的绝对吸光值，也会降低试剂的最低检测下限以及该方案的检测范围。标准方案（37°C下孵育）或者增强方案（60°C下孵育），建议使用水浴来加热试管。细菌培养箱传热不均匀，可能会导致显色上的明显误差。4.将所有试管冷却至室温。5.将分光光度计设定在562nm，使用一只仅装有水的比色皿将仪器调零。然后，在10分钟内依次检测所有样品的吸光值。注：由于BCA分析方法并没有达到真正的终点，因此，在冷却至室温以后仍然会继续显色。但是，在室温时的显色速率比较慢，如果在10分钟内完成所有样品的检测，则不会产生明显的误差。6.将各个标准品和待测蛋白质样品在562nm处的吸光值减去空白标准品在562nm处的平均吸光值。7.将BSA标准品在562nm处经过空白校正的吸光值对其浓度（µg/mL）作图，绘制标准曲线。使用该标准曲线来确定每个待测蛋白质样品的蛋白质浓度。微孔板方案（样品与工作液的比例=1:8）1.取各个稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各25L，加入到微孔板中（检测范围=20-2000g/mL）。注：如果样品有限，则可取标准品和待测未知样品10L（样品与工作液的比例为1:20）。然而，在这种情况下，定量分析的检测范围将被限制在125-2000g/mL。2.在每一个孔中加入200L工作液，并在震荡器上震荡30秒，使其充分混合。3.将微孔板密封，在37°C孵育30分钟。4.将微孔板冷却到室温。使用微孔板读数仪，测量样品在562nm或该波长附近的吸光值。注：该方法在波长540-590nm范围内均可成功得到结果。由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短，因此微孔板方案要求样品与工作液的比例更高，才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。如果想要得到较高的562nm处的吸光值，则需将孵育时间增加到2小时。延长孵育时间或升高温度将会增加样品在562nm处的吸光值，也会降低试剂的最低检测下限和该方案的检测范围。如果对标准品和待测样品均