ABSCIEX蛋白质组学完整解决方案

ABSCIEX蛋白质组学完整解决方案李春波博士市场部2©2013ABSCIEXDynamicExpression（时间、空间、环境、表型）DynamicComposition（剪切、拼接、翻译后修饰）DynamicLocation（原核、真核；亚细胞器、组织）DynamicInteraction（蛋白质、小分子、核酸、配体）背景回顾：蛋白质组的特征动态蛋白质组3©2013ABSCIEXHighdynamicrange高动态范围Proteinmodifications复杂的翻译后修饰Difficulttogetintothelowabundantproteins很难获得低丰度蛋白质Unabletodetermineacompleteproteome无法准确测定完整的蛋白质组背景回顾：蛋白质组学研究的挑战4©2013ABSCIEXABSCIEX为差异蛋白质组研究提供完整系统解决方案VerificationValidationDiscoveryTOF/TOF™5800SystemTripleTOF™5600SystemProteinPilot™SoftwareIsobaricmultiplexingreagentsQTRAP®5500SystemMRMPilot™SoftwareMultiQuant™SoftwareIsotopicmultiplexingreagentsScheduledMRM™AlgorithmMultiQuant™SoftwareAnalyst®SoftwareQuantitativeOptimizationScheduledMRM™AlgorithmQTRAP®5500System5©2013ABSCIEXABSCIEXMALDITOF与MALDITOF-TOF的发展历程1990年，全球第一套商业化MALDI-TOFVoyager推出;此后又首次推出反射型Maldi-TOF系统1995年,随着PerSeptiveBiosystems(现ABI公司的飞行时间质谱和蛋白中心）发明DETM（DelayExtration)技术，使飞行时间质谱技术真正大规模应用于蛋白质等生命科学研究成为可能，公司推出全球第一台高性能VoyagerDEMaldi-TOF,取名为VoyagerDEElite,Pro1996年，第一代VoyagerDESTR和DE-Pro(RP)1999年，第二代VoyagerDE-STR和DE-Pro2001年，第三代VoyagerDE-STR和DE-Pro2001年，世界第一台MALDI-TOF-TOF仪器，47002005年，MALDI-TOF-TOF，48002009年，MALDI-TOF-TOF,5800MALDI-TOF之父，MALDI-TOF技术发明人，TOF-TOF发明人，2010年美国质谱学会获得质谱终身成就奖MarvinVestal6©2013ABSCIEXABSCIEXTOF/TOFTOFTOF58007©2013ABSCIEXGelspotProteinspotMSMS/MSMS/MSMS/MSDatabasesearch来源于一个蛋白质PMF和MS/MS检索一个MS，N个MS/MS基于2D胶的技术路线+ABSCIEXTOF/TOFDIGE8©2013ABSCIEX差异蛋白质组的LC-MALDI解决方案iTRAQ+LC-MALDI+5800+ProteinPilot样品标记试剂数据分析软件数据采集质谱液相分离点靶系统iTRAQ试剂LC-MALDI液相点靶系统ABSCIEXTOF/TOF5800ProtienPilot软件9©2013ABSCIEXABSCIEXTripleTOF™系统特点灵敏度最高–MS和MSMS模式SmartSpeed™100Hz谱图采集频率–每张图谱最低只需10ms累积时间高分辨率–在所有扫描速度，所有质量范围，在高灵敏度的前提下EasyMass™质量准确度–~1ppmRMS(外标)线性动态范围–大于4个数量级可靠性–创新的磁悬浮分子涡轮泵，基本无机械损耗，低噪音高分辨率，高质量准确度，高灵敏度，高采集速度和高定量线性动态范围，在MS和MS/MS，在定性和定量，总是同时达到10©2013ABSCIEXTripleTOF系统--在生物标志物研究中的应用11©2013ABSCIEX蛋白质组学研究中质谱涉及的三大领域蛋白质鉴定（ProteinID）肽段序列鉴定蛋白质表征（ProteinCharacterize）分子量测定，翻译后修饰鉴定蛋白质差异表达，粗定量或半定量（相对定量）定量蛋白质组学（QuantitativeProteomics)蛋白质定量的确认和确证，真正意义上的蛋白质“相对”和“绝对”定量能同时满足从定性到定量的质谱仪TripleTOF系统发现蛋白质组学12©2013ABSCIEXABSCIEXTripleTOF系统三大工作流程在蛋白质组学中的应用13©2013ABSCIEXPowerfulWorkflowsEnableQualitativeandQuantitativeDataAcquisition1.Explore–Exhaustiveidentification2.Profile–High-resolutionMSquantificationwithMS/MSconfirmation3.Quantify–RigorousquantitationinMS/MSmode14©2013ABSCIEX各种工作模式下的应用实例−1.Explore–1.酵母细胞样品的高通量蛋白质鉴定–2.iTRAQ应用实例−2.Profile–High-resolutionMSquantificationwithMS/MSconfirmation−3.Quantify–RigorousquantitationinMS/MSmode15©2013ABSCIEXApplicationofEXPLORE1.酵母细胞样品的高通量蛋白质鉴定16©2013ABSCIEX应用举例Explore工作流程用于蛋白质鉴定信息相关（IDA）工作模式目标是花尽可能多的时间在MS/MS上–在该模式下，每次IDA工作循环的总时间固定–用户设定最大被分析的母离子数目和最小质谱累积时间–实际的累积时间由质谱根据一级图谱中实际存在的母离子数目动态平均分布方法可直接调用模板方法由软件提供–ProtsimpleIDA–ProtcomplexIDA最多每秒可进行50MS/MS采集18©2013ABSCIEX各种工作模式下的应用实例−1.Explore–1.酵母细胞样品的高通量蛋白质鉴定–2.iTRAQ应用实例−2.Profile–High-resolutionMSquantificationwithMS/MSconfirmation−3.Quantify–RigorousquantitationinMS/MSmode19©2013ABSCIEXiTRAQ-生物标志物研究的利器2013年中、，900篇英文文献90%的工作使用ABSCIEX的仪器20©2013ABSCIEX北京大学人民医院血液生物标志物2010国内用户使用iTRAQ的最新工作中南大学湘雅医院2012MCP复旦大学附属中山医院2011JPR21©2013ABSCIEXiTRAQ应用举例PlantGuard细胞的定量蛋白质组研究22©2013ABSCIEX各种工作模式下的应用实例−1.Explore–1.酵母和大肠杆菌细胞样品的高通量蛋白质鉴定–2.iTRAQ应用实例−2.Profile–High-resolutionMSquantificationwithMS/MSconfirmation−3.Quantify–RigorousquantitationinMS/MSmode23©2013ABSCIEXApplicationofPROFILEinQual-QuantStudy24©2013ABSCIEXUpto50MS/MSspectrapercycle−信息相关采集模式IDA−目标是对每个肽段的母离子的一级质谱，在其色谱半峰宽的时间内，获得6-8个数据点用于一级质谱定量。–平均色谱峰宽十分关键−质谱采集速度的大幅提升，保证获得足够多的数据点，从而使得LabelFree的定量结果更加可靠，灵敏度的大幅提升保证了更多的低丰度肽段能够获得定量和鉴定信息−扫描速度和灵敏度的提升保证了采用标记策略的所有质谱定量技术路线都能获得更好的支持−在低分子量端依然保持高分辨、高准确度，确保获得更高质量的iTRAQ实验数据，且一级和二级定量结果能够轻易拟合高质量准确度，高分辨率，高度可重复的一级质谱定量结合同样高质量的MS/MS，能够轻易实现并超越肽段的鉴定和定量。应用举例Profile工作流程用于蛋白质鉴定和定量25©2013ABSCIEXIGEGTY[Pho]GVVYKy6y5y7b2y2y112+y8b3y3y10QualandQuantinaSingleAcquisitionPhospho-TyrosinePeptidefromCDC-2_HUMANHighresolutionTOFMSprofileforQuantHighresolutionTOFMS/MSfordefinitiveIDpTyrImmonium+y626©2013ABSCIEX高分辨一级质谱MS定量高质量准确度、高分辨率的选择离子色谱图XIC增加了定量的专一性高质量准确度和高分辨率的一级质谱图必然得到高质量准确度的选择离子色谱图，从而获得超高的专一性522.0522.5523.0523.5524.0Mass/Charge,Da0500010000522.7892Intensity,cps1516171819202122Time,min0e05e41.015e6Intensity,cpsXIC峰宽(m/z)0.700.300.0527©2013ABSCIEXApplicationofQUANTIFYHighResolutionMRM(MRMHR)28©2013ABSCIEXMRMHR工作模式TOFMS/MS数据采集后的提取信息随着液相色谱的分离，一系列高分辨（分辨率15,000或30,000）的TOFMS/MS图谱被连续采集；单个或多个高解析度的XIC在数据采集后被提取生成；之后的定量方法与MRM类似；高采集速度保证了多肽的洗脱过程中有足够的点被采集，形成高质量的XIC结果300500700900Mass/Charge,Da010000Intensity,cps23.024.025.0Time,min***************29©2013ABSCIEXMRMHR定量工作流程用MRMHR进行目标蛋白或多肽的定量TripleTOF™系统是唯一能够进行MRMHR这种高分辨的，类似MRM的定量技术的质谱；它的最低定量限和线性动态范围都与高端的三重四级杆质谱相当；即使采用超快的UPLC分离，TripleTOF™系统超快的采集速度（cycletime可短至10ms）也能帮助获得高解析度的XIC数据；定量时不需方法优化；众多的碎片离子信息被采集以供选择。30©2013ABSCIEX用MRMHR对多肽进行定量HighResolutionMRM-likeQuantitation-MRMHR随着液相色谱的分离，一系列高分辨率（20,000）的TOFMS/MS图谱被连续采集；在TOFMS/MS数据采集后，以5mDa的窗口提取生成多个高解析度的XIC；许多碎片离子可以用来挑选和/或合并y8y6y5y7b2y3y4y9DQGGELLSLR844.490±0.005Da244.093±0.005Da601.406±0.005Da18780resolution19452resolution17302resolutions/n=6903s/n=9720Productionssummed31©2013ABSCIEX高分辨的MRM