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实验室内部的人胚胎干细胞protocol人类胚胎干细胞H1和H9维持方案一、试剂配制饲养层细胞培养基Fibroblast-DMEMMedia(F-DMEM)DMEM(GIBCO11960-044)450mlFCSGIBCO16000-04450ml10%Pen/Strep2.5ml50IU/mlL-glutGIBCO25030-0815ml2uM/ml人类胚胎干细胞培养基HESC-MediaKO-DMEDGIBCO10829-018480mlKOSRGIBCO10828-028120ml20%10mMNEAAGIBCO11140-0506ml0.1mML-glut(0.2M)GIBCO25030-0816ml2mMPen/Strep3ml55mMBMEGIBCO21985-0231.1ml0.1mMITSGIBCO41400-0456ml4-80C避光保存。用前每50毫升加200-400ngbFGF细胞冻存培养基FBS-DMSOFCSGIBCO16000-0449ml90%DMSOSIGMAD26501ml10%细胞消化液Trypsin-EDTA0.25%Trysin-1mMEDTAGIBCO25200-0562ml0.05%,0.2mMPBS(-)14190-1448mlMEF细胞有丝分裂终止液MitoCMitomycinC0.2mg0.05mg/mldd-H2O15230-1624ml避光保存。MitoC的终浓度为10ug/ml即40吸ul工作液加到2mlF-DMEM中。.0.1%Gelatin(用于培养皿的包被)1%Gelatin40ml0.1%ddH2OGIBCO15230-162360ml高压消毒。二、培养方案一)饲养层细胞的培养1、主要实验材料（1）培养液为F-DMEM。（2）小鼠周龄为7～8w的性成熟母小鼠和周龄为8w的种公鼠。2.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养（1）小鼠胚胎的准备1)性成熟母小鼠与种公鼠按1公（♂）:2母（♀）比例合笼。2)每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物(阴道栓)即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的0.5d。3)取怀孕12.5～14.5d母鼠,断颈处死，无菌条件下暴露子宫。4)用镊子提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角。5)取出整个子宫,在无菌滤纸上吸干血迹,置于有PBS或无血清DMEM平皿内。用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。6)沿子宫系膜侧剪开子宫,取出带有胎膜的胚胎,置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,充分洗涤,弃除表面红细胞。7)用小镊子撕破胎膜,取出胎鼠,弃除胎膜,用PBS洗涤三次。8)去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS或无血清DMEM平皿内,用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。（2）小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养二)培养方法有两种:组织块培养法和单细胞悬液培养法。组织块培养法：1)用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪(切)成1mm3以下的碎块,吸置于离心管内。2)室温下静置5～10min,弃上层液，留下胚胎组织碎块。3)向装有鼠胚组织碎块的离心管内加入1ml消化液,轻轻吹吸30sec。4)加入等体积的培养液终止消化。室温下静止5-10min。5)弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物。6）加入5ml培养液重新悬浮鼠胚组织块,移入培养瓶内。每5个鼠胚的组织块可使用1个100ml的培养瓶。7)补加适量的培养液,使组织块悬浮液能均匀分布于培养瓶表面。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。8)培养开始的前两天不要晃动培养瓶。第三天见组织块附着培养瓶表面,周围生长出细胞。补充培养液或更换培养液,继续培养。每天观察。9)待细胞连成一片时,即可消化。消化时弃培养液,用PBS洗涤一次；加适量消化液（以能覆盖细胞层为度），在室温下作用大约30sec；弃消化液，让残余消化液继续作用。轻敲培养瓶底,当细胞层出现裂隙时，加入培养液终止消化。或在倒置显微镜下观察，当细胞与细胞之间分开即可终止消化。10）补加培养液，轻轻吹打均匀，吸置离心管内，静置5～10min。11）上层为单细胞悬液,下层为组织块沉淀。将上层单细胞悬液轻轻吸置另一离心管内,弃组织块。12）以800～1000rpm5min离心，弃上清。加入培养液,重新悬浮细胞沉淀。以1:3比例传代。采用3～5代细胞作为饲养细胞。单细胞悬液培养法：1)～5）步骤同组织块培养法1)～5)步骤。6)重复组织块培养法3）～4）步骤5～6次,即重复消化鼠胚组织块5～6次。每次消化后都收集上层液即单细胞悬液。最后一次消化后弃组织块。７)将收集到的单细胞悬液离心，800～1000rpm5min。８)弃上清,加入培养液,轻轻吹吸,制备成均匀的单细胞悬液。9)移置培养瓶内。5个鼠胚制备出来的单细胞悬液可以使用3个100ml的培养瓶。10)补加适量的培养液，吹吸均匀。37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内培养。每天观察。11)培养2～3d后,细胞连成片,即可消化。消化过程同组织块培养法９)步骤。12)以1:2～1:3比例传代培养,2～3d传一代。采用3～5代细胞作为饲养细胞。（3）培养结果在培养MEF初始的1～2代时,杂细胞（非成纤维细胞的其他组织细胞）较多,细胞形态多样；在第三代开始时,杂细胞逐渐减少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时,由于受杂细胞的影响,形态不够典型。三）细胞冷冻1.当细胞90%-100%融合时,尤其细胞少量堆聚可冷冻。2.处理方法同传代培养1-8，每25cm2的细胞加1mlFBS-DMSO重悬细胞。3.每个冷冻管编号加1ml细胞悬液。4.置入40C1小时，放入1cm厚的泡沫盒中置入-800C过夜，置入液氮长期保存。四）灭活饲养层细胞并备饲养层皿试剂和材料HESCMedium、PBS(+)、PBS(-)、MitoC、Trypsin-EDTA离心管、移液管MitoC处理（以25cm2培养瓶为例）1.需要铺皿前一天，全换液。.2.留2ml培养基。3.加40ulMitoC（10ug/ml）。4.培养皿底以0.1％Gelatin溶液覆盖预处理。5.3小时后，去培养基，处理方法同传代方法。6.重悬细胞，细胞计数，以、7.0×104/cm2（MEF）铺皿。7.置于培养箱常规培养。8.15分钟后，取出皿，吹打皿中央，重新置于培养箱中培养。五、复苏及冻存hES细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15mlFalcon管中；4．加入5mlES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心200g×5min；6．弃上清，用2mlES培养基重悬细胞，吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。冻存细胞冻存液：90％HS和10％二甲基亚砜步骤：1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2．用细胞刮刀收集细胞；3．将细胞转入15mlFalcon管内并离心200g×5min；4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中。5．分装于冻存管内，每管1ml；将冻存管装入Nalgen冻存盒内。6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。转载自丁香园1、StemCellAnalysis干细胞分析（功能、表型、核酸含量、边群）[LondonResearchInstitute]briefintroduction：StemCellAnalysis,FACSLaboratory,LondonResearchInstitute干细胞分析，包括以下四方面内容：FunctionalAnalysisPhenotypingNucleicAcidcontentSidePopulationanalysis2、ProductionofESCellChimerasbyAggregationwtihEight-CellStageEmbryos[NagyLab，MountSinaiHospital]briefintroduction：ProductionofESCellChimerasbyAggregationwtihEight-CellStageEmbryos[NagyLab，MountSinaiHospital]3、ProductionofCompletelyESCell-DerivedFetusesbyAggragationwithTetraploidEmbryos[NagyLab，MountSinaiHospital]briefintroduction：ProductionofCompletelyESCell-DerivedFetusesbyAggragationwithTetraploidEmbryosNagyLab，MountSinaiHospital4、PickingESCellColoniesandTransferringThemto24-WellCultureDishesbriefintroduction：PickingESCellColoniesandTransferringThemto24-WellCultureDishesFromtheLaboratoryofDr.AllanBradleyBaylorCollegeofMedicine,Houston,Texas5、PreparationofFeederLayersAndSNLStocks[BaylorCollegeofMedicine]briefintroduction：PreparationofFeederLayersAndSNLStocks,AllanBradley'sLab,BaylorCollegeofMedicine,Houston,Texas6、Preparing48-WellPlateFeeders[BaylorCollegeofMedicine]briefintroduction：Preparing48-WellPlateFeedersFromtheLaboratoryofDr.AllanBradley,BaylorCollegeofMedicine,Houston,Texas7、FreezingEmbryonicStem(ES)CellClonesin96-WellPlates冻存96空板中的胚胎干细胞克隆[BaylorCollegeofMedicine]briefintroduction：FreezingEmbryonicStem(ES)CellClonesin96-WellPlatestheLaboratoryofDr.AllanBradley,BaylorCollegeofMedicine,Houston,Texas8、InVitroDifferentiateEScellsintoglialcellsandneurons胚胎干细胞体外分化为神经元和神经胶质细胞(NagyLab，MountSinaiHospital)briefintroduction：DifferentiateEScellsintoglialcellsandneurons,NagyLab，MountSinaiHospital胚胎干细胞体外分化为神经元和神经胶质细胞9、InVitroDifferentiationofESCellsintoCysticEmbryoidBodies胚胎干细胞体外分化为囊胚体(NagyLab，MountSinaiHospital)briefintroduction：InVitroDifferentiationofESCellsintoCysticEmbryoidBodies,NagyLab，MountSinaiHospital胚胎干细胞体外分化为囊胚体10、InVitroDifferentiationofESCellsintoCardiacMuscle胚胎干细胞体外分化成心肌细胞(NagyLab，MountSinaiHospita