分子克隆步骤

1分子克隆流程及步骤1PCR扩增目的基因片段模板1μL-20℃小提质粒的盒子引物1（10μmol）1μL-20℃标有引物的盒子100μL体系引物2（10μmol）1μL物品位置：-20℃标有引物的盒子2×Taqmix50μL-20℃分子克隆工具酶1Pfu高保真酶1μL分子克隆工具酶1dd水46μL4℃冰箱长盒子中PCR循环：94℃5min-----94℃1min----59℃1min----72℃1min-----72℃1min-----4℃2h变性反应变性反应复性温度延伸反应延伸反应保存30cycle注：1HSMix与Taqmix一样；2PCR盖子温度94℃；3退火温度视不同引物碱基，公式为：T=2(G+C)+(A+T)最适合温度为T的上下2-5℃；4PCR产物保存在4℃，过夜则保存在-20℃2PCR扩曾产物的凝胶电泳，拍照为了检验PCR的扩增结果需对其进行琼脂糖凝胶电泳分析。（电压8V/cm，电泳槽正负极间距离）取出5-6μL样品于电泳槽中，DNAmarker3-5μL，电泳至过凝胶1/2在紫外下观察，必要时拍照。注意电泳时的正负极，DNA和蛋白质都是从负极向正极跑。电压的控制为8V/cm，大槽一般电压为小胶100V，大胶160V，小槽电压一般为80V。附注：配琼脂糖凝胶的方法：2g琼脂糖（BIOWESTREGULARAGAROSEG-10）,200ml0.5×TBE在微波炉中加热5min两次直至煮沸完全溶解，冷却后加入EB倒入模具中即可。EB有剧毒注意戴手套3PCR扩增产物的纯化本步骤为试剂盒的纯化，详细步骤见TakaRaFragmentpurificationkitver2.0的说明书注：1提取试剂盒有不切胶纯化和切胶纯化两种，参照不同的说明书进行操作。2操作到第六步后弃滤液空柱子离心2min（1200r/m)，丢弃滤液，将柱子放入新的离心管中（从超净台里面取）至烤箱中2min，同时将ElutionBuffer放入烤箱中2-5min，再接第七步后面的步骤。3纯化后的PCR产物保存在-20℃冰箱第二层的纯化产物的方盒中4纯化PCR产物的酶切（buffer与体系比为1：10）（5ug）（小提质粒，且低拷贝量少的质粒）DNA(PCR扩增产物)5μLDNA（载体）35μL5×Buffer5μL10×Buffer10μL50μL体系EcoRⅠ2.5μL100μL体系EcoRⅠ5μLXhoⅠ2.5μLXhoⅠ5μLdd水35μLdd水50μL分别将Rheb基因和载体在37℃水浴中酶切过夜一般在12h左右25酶切产物的电泳，将所需特定的产物片段切胶回收并拍照在超净台中取出一个Ep管，称重标记；酶切产物的电泳，将所需特定的产物片段切胶回收并拍照；用带胶试剂盒纯化酶切产物。（-20°C保存）6连接片段与载体1连接试剂盒放在-20℃第一层的右边，将试剂盒中Ⅰ取10μL分别放入新的Ep管中标明不同片段的序号，solutions与试剂加片段的比例一般以1:1（TakaRa链接试剂盒的solutionⅠ：中段+vector=1:1），片段与载体量1:1但可随各自多少调整。2取载体4μL-5μL分别放入上面的两个Ep管中3取片段5μL-6μL分别放入上面的两个Ep管中4稍微离心一会，放入PCR仪器中16℃过夜，18hligaseligastion经典体系：DNA片段vectorddH2O短暂储存在4°C，建议用新鲜感受态。长期保存在-70°C。加15-30%甘油保存7转化1取感受态细菌100μL（感受态细菌在4℃存放），加入连接产物20μL混匀，冰浴30min242℃热冲击90s，冰浴2-3min3每管加入880μLLB培养基，37℃200rpm，50min在摇床上摇荡，此步骤时将培养平板放于37℃孵箱中预热4离心，6000r/min，保留100-200μL上清，重悬细菌，涂板，在超净台中吹干后放入37℃孵箱中12h后看是否长出克隆，如果长出克隆则进入55从孵箱中取出平板到超净台6准备好细长的培养细菌用的玻璃管，加入5-6mL的氨苄培养基（抗性要根据所用载体而选）7取一支牙签将平板上℃的克隆挑起，倾斜长管将克隆种入长管中8拿出放入摇床上，37摇晃12-16h，观察有无细菌长出（是否培养基变混浊）若有（可以用PCR法先初步鉴定是否为阳性克隆，再对初步鉴定阳性的克隆抽提质粒，酶切进一步鉴定）则进入步骤8，在有的情况下这些细菌放入4℃冰箱中短暂保存，长期保存则放入-70℃加15%-30%甘油保存。附：1制备细菌感受态（1）从-70℃中取出菌种，解冻后放入超净台，吹打细菌混合均匀，（2）取一支细长的玻璃管，加入5-6mlLB培养基（不加氨苄)（3）从Ep管中吸取100μL的细菌加入长细玻璃管中，放入摇床上摇过夜（4）次日取50ml的大离心管加入20ml的LB培养基，从细长的玻璃管中吸取200μL的菌液放入离心管中在摇床上摇3-4h。（5）取出细菌放入冰上10min，后在4℃离心机上离心10min3（6)倒掉上清，加入CaCl4ml，位置在旁边冰箱上层大瓶子中。将沉淀细菌轻轻吹起（7）将吹好的悬浊液放入冰上15min（8）将细菌放入4℃离心机离心10min（9）取出倒掉上清，加入CaCl1.5ml轻柔吹散。（10）取出几个Ep管，将上步的细菌分装入Ep管中，标记Top10及日期2配置LB培养基方法1LB液体培养基1L体系：950μL去离子水10.0g胰蛋白冻（bacto-tupton）5.0g酵母提取物（bacto-extract）10.0gNacl搅拌溶解5mol/LNaOH约0.2mol调pH至7.0此步不做定容，高压2LB固体培养基1普通型：液体LB+1.5%琼脂（15g/L）高压灭菌20min，无菌铺板2选择型：高压后的固体培养基冷却至50℃时添加必要成份摇匀，无菌铺板2-3mm厚，室温固化成份100mL200mL300mL500mLPr冻1.0g2.0g3.0g5.0g酵母0.5g1.0g1.5g2.5gNaCl1.0g2.0g3.0g5.0g琼脂粉1.5g3.0g4.5g7.5g3CaCl制备感受态细菌用0.1mol1.1gCaCl溶解于90ml双蒸去离子水中定容100ml高压，4℃保存8PCR鉴定重组质粒为了对7中的细菌中是否为真的重组质粒进行鉴定，需做PCR鉴定。需加阴性对照模板0.7μL引物10.7μL20μL体系引物20.7μL2×Taqmix10μLdd水8μL对PCR结果进行电泳看是否出现目的条带，阴性对照的模板为水它不会出现条带，或者阴性对照的条带明显弱于其它的条带，选取阳性克隆抽提质粒进入第9步，对质粒进行酶切进一步观察，电泳观察有无目的片段切出，选取酶切鉴定，阳性的质粒或菌液送测序，将阳性的菌液加甘油冻存于-70℃。49质粒的提取（试剂盒在师姐桌子上粉红色的盒子中）1拿出8中的细菌分装至Ep管中7000r/min离心2min至细菌沉淀至管底2倒掉上清，再次加入细菌离心7000r/min离心2min3P1在4℃冰箱最下层4以下按照质粒提取试剂盒的步骤来做，最后一步加入50μL的洗脱液10提取质粒的酶切鉴定10×buffer2μLEcoRⅠ1μLXhoⅠ1μLdd水13μL37℃酶切10min，跑电泳看是否有条带11冻存细菌原本细菌放在4℃冰箱，取出细菌放入摇床上摇晃0.5-1h使原来沉在管底的细菌摇起来，取新的细长玻璃管，加入氨苄的培养基，将上面的细菌取出200-300μL,放入摇床上过夜。注意无菌操作。