工业工程之工艺研究--SOP的作用与重要性

分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)3、移至1.5mlEP管，静置5分钟4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4度7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、100ullysisbufferforeachtail,and2ul10mg/mlPK,55℃,overnight.2、Then,100℃for10mintodenaturethePK,use0.5~1ullysateastemplatetodoPCR.Lysisbuffer:(storeat4℃)KCl0.5MTris0.1MNP-401%Tween-201%二、RT-PCR：1、预变性体系12ul：TotalRNA2ulOligo（dT18）primer1ulDHwater9ul65℃5min速置冰上2、RT体系：20ul：预变性体系12ul5×buffer4ulRNAaseinhibiter1ul10mdNTP2ulMMLV1ul42℃60min70℃5min12℃forever3、PCR体系20ul：10×buffer2ul10mdNTP0.5ulPrimer(F+R)1ul（0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ulPfu0.2ulddwater15.3ul95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑胶鉴定PCR产物：四、醇沉PCR产物：1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀3、—80℃静置30min4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干6、加入25-20ulddwater吹匀静置10-20min待溶解五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme11ulEnzyme21ul10×Buffer5ul（在体系中被稀释成1×）10×BSA5ul（看需要）Template1ugADDddwaterto50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用DNA回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）PCR酶切产物纯化：1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳2.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。3.加入BufferQG（每100mg凝胶加BufferQG300μl），置50℃水浴10min,每隔3,min涡旋一次至完全溶解，若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。4.加10ulNaAc调pH值（至7.5.），混匀。若液体颜色同QG，则无需调pH值。5.将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上，静置3分钟，可分次做,每次不超过800ul。6.4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。7.加入500μlBufferQG于柱上，4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。8.加入750μlBufferPE于柱上，静置3min，4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。9.4℃离心12000rpm×1min。弃去收集管。空柱离心？静置20-30min。10.将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μlBufferEB或水于柱上。放置1min，4℃离心17900rpm×1min。11.测浓度，可取5μl回收DNA电泳检测鉴定。注意事项：紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。载体纯化：1、胶回收载体酶切产物，方法同PCR酶切产物胶回收。2、CIAP体系60ul：Vector50ulBuffer6ul（占1/10体系)Cip1ulddwater3ul混匀，37℃90min3、进一步纯化：①加入3倍与cip体系体积的BufferII，置50℃水浴10min,每隔3,min涡旋一次。②将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上，静置3分钟。③4℃离心12000rpm×1min，弃去收集管中液体。④加入500ulwashsolution12000rpm×1min弃液体。⑤再加入500ulwashsolution12000rpm×1min弃液体。⑥空柱离心12000rpm×30s⑦将柱放于一新1.5ml离心管上，开盖静置20-30min，加50μlBufferEB，50℃水浴3分钟。⑧4℃离心17900rpm×1min。⑨测浓度。八、连接：体系20ul：10×DNALigaseBuffer2ulDNALigase1ulVector0.03pmolInsert0.09~0.3pmolNuclease-freewaterto20ulX℃、Xhours1pmol的1000bp大小的DNA片段质量约为0.66ug即：66ngvector：insert=1:3~10九、感受态细胞涂板复苏挑单克隆：十、单克隆摇菌扩增：十一、转化、涂板（简略）：1、将5ul连接产物加入到50μL？感受态细胞中，混匀，冰浴60分钟。（－80℃储感受态需先手捂解冻后冰上放置10min）。2、把转化管转移至42℃水浴锅中，准确计时90s。3、把转化管迅速转移至冰上，2-3分钟。4、向每个转化管中加入800μL？无抗LB培养基，37℃摇床170rpm温育60min。5、吸取100μL？涂布于含有相应抗性的LB琼脂平板上。6、倒置？平板培养37℃温箱过夜，转化克隆应该于12-16小时区间出现。十二、挑单克隆摇菌、摇菌：1、加入3ml含抗LB培养基于一新的摇菌管中。2、标记单克隆，枪头挑菌后放入摇菌管。3、37℃、215rpm过夜。十三、手提质粒：提质粒前注意留种（850ul菌液+150甘油，取200ul分装至EP管）1、从剩余菌液中取1.5ml左右至新的EP管中，8000rpm离心沉淀2~3min弃上清。2、每管加100ulSolutionI重悬震荡涡旋混匀。3、每管加200ulSolutionII轻柔混匀。4、每管加150ulSolutionIII轻柔混匀（果冻状），速置冰上5min。5、4℃13500rpm离心5~10min，回收上清液。6、转移上清至新的EP管中，每管加300ul酚氯仿，4℃13500rpm离心3min，回收上清至新EP管。7、每管加0.7倍体积异丙醇，涡旋混匀，RT静置10min或—20℃静置3~5min（不宜久，防盐沉）。8、4℃13500rpm离心10min弃上清。9、每管加800ul70%Ethanol洗涤一遍。10、4℃13500rpm离心10min弃上清，自然晾干。11、每管加30~50ulddH2O。12、测浓度。Solution配方：十三、酶切后跑胶鉴定：十四、测序：十五、制作细菌超级感受态细胞（分子克隆III）＊KCM法感受态制备：1、从冻存菌种中挑菌于4ml无抗LB培养基中，215rpm，37℃培养箱过夜。2、第二天以1:100接种于100mlLB培养基中。37℃,215rpm培养2~3h，测定OD值=0.3~0.4（0.5）3、将OD适中的菌液置于冰上20min。4、将100ml菌液转至2个50ml管中，4℃5000rpm离心5min，弃上清，将沉淀置于冰上。5、每管加入5ml预冷的TSS（用量为菌液体积的1/10），冰浴下小心重悬，重悬充分后，将两管5ml菌液混合为一管10ml，加入2.5ml50%甘油（终浓度为10%），静置15min。6、准备一个液氮盒，每管80ul分装于0.5mlEP管中，置于液氮中，最后存在—80℃.TSS配方：