PDF-中国马铃薯疮痂病病原菌16SrDNA的遗传多

中国农业科学2009,42(2):499-504ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.02.015收稿日期：2008-01-23；接受日期：2008-03-17基金项目：国家“863”计划项目（2006AA10A211），国家自然科学基金项目（30700523）和河北省自然科学基金项目（C2005000252）作者简介：张萌（1982－），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向为植物病理学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]。通信作者刘大群（1958－），男，河北灵寿人，教授，博士，研究方向为植物病害生物防治与分子植物病理学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]。通信作者赵伟全（1975－），男，黑龙江东宁人，副教授，博士，研究方向为植物病害生物防治与分子植物病理学。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]中国马铃薯疮痂病病原菌16SrDNA的遗传多样性分析张萌1，赵伟全1，于秀梅1,2，杨文香1，张汀1，刘大群1（1河北农业大学植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北保定071001；2河北农业大学生命科学学院，河北保定071001）摘要：【目的】利用16SrDNA序列对来自中国8个省（区）的34株马铃薯疮痂病菌和15株参比菌株进行系统发育分析。【方法】采用链霉菌通用引物对34株测试菌株的基因组进行16SrDNA序列扩增，测序后在GenBank中进行BLASTn比对，选取同源性较高的菌株构建系统发育树。【结果】34个测试菌株均为链霉菌属，其中Streptomycesscabies12株、S.galilaeus8株、S.bobili6株、S.turgidiscabies1株、S.acidiscabies1株、S.diastatochromogenes2株、S.setonii1株、S.enissocaesilis3株。其中S.galilaeus、S.bobili和S.enissocaesilis等种均为新发现的疮痂病病原。对各菌株的分布分析发现，山东省的疮痂病菌有4种，内蒙古自治区和陕西省有3种，四川省、河北省和山西省均有2种，黑龙江省为1种。【结论】中国马铃薯疮痂病菌存在明显的遗传多样性，且分布较为复杂。关键词：马铃薯疮痂病；链霉菌；16SrDNA序列；遗传多样性GeneticDiversityofPotatoScabPathogensinChinaBasedon16SrDNASequencesZHANGMeng1,ZHAOWei-quan1,YUXiu-mei1,2,YANGWen-xiang1,ZHANGTing1,LIUDa-qun1(1CollegeofPlantProtection,AgriculturalUniversityofHebei/BiologicalControlCenterofPlantDiseasesandPlantPestofHebeiProvince,Baoding071001,Hebei;2CollegeofLifeScience,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,Hebei)Abstract:【Objective】Phylogenetictreewasconstructedfrom15standardpotatoscabpathogenstrainsand34scab-causingstrainsisolatedfrom8provincesinChinabasedonthe16SrDNAgenesequences.【Method】16SrDNAsequenceswereobtainedusingStreptomycesgenusuniversalprimersandgenomicDNAasamplifiedtemplatebyPCRtechnique.BLASTnalgorithmwasusedtosearchalignmentforthesequencesof16SrDNAgenefromthe49strainsagainstGenBanknucleotidedatabase.Amongthem,strainswithhighersequencehomologywereusedtoconstructaphylogenetictreebyClustalX1.8andMEGA2.1softwares.【Result】Basedontheresultsofphylogeneticanalysis,the34scab-causingstrainstestedinthispaperwereattributedtotheStreptomycesgenus.Amongthem,12strainsbelongtoS.scabies,8toS.galilaeus,6toS.bobili,2toS.diastatochromogenes,1toS.turgidiscabies,1toS.acidiscabies,1toS.setonii,and3toS.enissocaesilis.Moreover,S.galilaeus,S.bobiliandS.enissocaesilisareidentifiedasnovelpotatoscabpathogensforthefirstreport.FourstrainswereisolatedfromShandongprovince,3fromInnerMongoliaprovinceand3fromShaanxiprovince,2fromHebeiprovince,2fromShanxiprovince,1fromHeilongjiangprovince.【Conclusion】ResultssuggestedthatgeneticdiversityandcomplexregionaldistributionexistedforpotatoscabpathogensinChina.Keywords:potatoscab;Streptomyces;16SrDNAsequence;geneticdiversity500中国农业科学42卷0引言【研究意义】马铃薯疮痂病（potatoscab）在世界各国马铃薯种植区均有发生[1-3]。该病主要由植物病原链霉菌引起，表现为侵染点周围的组织坏死，形成平状、凸起或凹陷的痂状病斑，影响马铃薯的品质和市场竞争力。近年来，随着市场对马铃薯品质的要求日益提高，马铃薯疮痂病已成为妨碍马铃薯生产的主要问题之一。中国马铃薯种植区域广泛，疮痂病发生也较为普遍，对微型薯生产的影响尤为严重，有的地区微型薯发病率已达30%～60%[4]。目前中国对马铃薯疮痂病的研究多数集中在对该病的防治方法的探索[5-6]，亟需对该病的病原菌进行系统深入研究。【前人研究进展】引起疮痂病的病原菌较复杂，至今已鉴定和报道了多种疮痂病原菌，多为链霉菌属，包括S.scabies[7]、S.acidiscabies[8]和S.turgidiscabies[9]等，并不断有一些新的链霉菌致病种被发现[10-11]，呈现出较大的多样性。传统上，对马铃薯疮痂病菌的鉴定方法主要是依据菌株的培养特征、形态学特征及生理生化特征进行生物学分类[12]。近年来，利用16SrDNA序列对菌株进行分子鉴定在很多物种的鉴定中都取得了较好的效果[13]，现已成为细菌菌种鉴定的必要条件之一。【本研究切入点】已有很多研究者利用链霉菌的16SrDNA序列成功对链霉菌进行系统分类鉴定，借助该方法可有效区分不同的马铃薯疮痂病原菌，并可对病原菌的遗传多样性进行系统分析[14-16]。在前期工作中，笔者已对中国不同地区的马铃薯疮痂病菌进行了采集和致病性测定[17]，并成功利用16SrDNA序列对分离到的4株疮痂病菌进行了鉴定[18]。【拟解决的关键问题】对来自中国不同地区的34株马铃薯疮痂病菌的16SrDNA序列进行聚类分析，旨在从分子水平探明中国马铃薯疮痂病菌的遗传多样性，为进一步研究该病原菌的形成和病害防治提供信息。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株采用刘大群等[3]的方法自中国8个省（区）采集到马铃薯疮痂病菌34株。各菌株来源为：河北省7株：06-1，06-3，06-4，HB-3，HB-4，BD-121，BD-122；内蒙古自治区4株：NM-2，NM-5，NM-15，NM-41；四川省5株：SC-13，SC-14，SCP-1，SCP-2，CPS-4；山东省5株：SD-3，SD-4，CPS-3，SD-Z，SDT-5；陕西省5株：SHX-100，SHX-101，SHX-102，SHXFF-2，SHXHZ-3；山西省3株：CPS-2，SX-3，SX-4；黑龙江省4株：CPS-1，HLJ-5，Hhr-1，Hhr-2；甘肃省1株:GS-5。1.1.2培养基燕麦固体培养基（每升含燕麦片18g，琼脂15g，pH7.2～7.5）。1.1.3主要试剂和仪器Taq酶、DNA凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自宝生物公司（TaKaRa），pGEM（R）-TEasy载体购自Promage公司，离心机和PCR仪为Eppendorf公司产品，其它试剂为国产分析纯。1.2菌丝培养和基因组DNA提取各菌株菌丝培养和基因组的提取参照《PracticalStreptomycesGenetics》[19]中的方法进行。1.316SrDNA序列扩增采用链霉菌16SrDNA序列通用扩增引物，引物序列为：P（u）：5'-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3'；P（d）：5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，55℃50s，72℃1min，30个循环，最后72℃5min。1.4序列测定获得的PCR产物经DNA凝胶回收试剂盒纯化后，克隆到pGEM（R）-TEasy载体上转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，利用质粒提取试剂盒提取质粒后，交由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.5序列分析与系统发育树的构建利用PCR序列拼接软件ContigExpress，参照正、反向序列图谱，对全部34个菌株的16SrDNA序列进行校对，各序列的数据库登录号为：EMBLaccessionNo.：AM889468－AM889497；GenBankaccessionNo.：CPS-1（AY621064）、CPS-2（AY621378）、CPS-3（AY621376）和CPS-4（AY621375）。然后在GenBank中进行BLASTn比较，选取同源性较高的登记菌株16SrDNA序列作为参比序列。用CLUSTALX1.8软件进行多序列比对，由MEGA2.1软件采用邻接法（Neighbor-Joining）进行系统发育树构建和聚类分析。2结果与分析2.1基因组提取和16SrDNA扩增结果提取的各菌株基因组DNA经电泳检测为30～50kb，满足下游操作的需求。以P（u）和P（d）为引物对测试中34个菌株的基因组进行扩增，均能扩增2期张萌等：中国马铃薯疮痂病病原菌16SrDNA的遗传多样性分析501出约1500bp的16SrDNA片段（图1）。经回收、测序和序列校对后，在NCBI数据库中进行BLASTn比较，分别选取相似性较高的登记菌株用于多序列比对，构建系统发育树。选取的参比链霉菌菌株为：S.acidiscabiesATCC49003（D63865），S.bobili（AB045876），S.caviscabies（AF112160），S.M：DL2000分子标记；1，2：PCR产物M:DL2000marker;1,2:PCRproducts