实验一、16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析

马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话：62336016；Email:[e-mail]现代微生物学实验技术实验内容♣16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取16SrRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析窦桂铭实验目的1.掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识；2.掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题研究奠定基础。PCR（PolymeraseChainReaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序设想—实现—改进与完善72℃94℃55℃PCR循环PCR技术的反应原理PCR技术的反应原理DNA或RNA模板5´5´待扩增DNA区域3´94℃5min5´5´55℃退火5´5´聚合3´3´5´5´3´循环25-30次变性70℃DNA引物DNA聚合酶dNTPsMg2+（缓冲液）12①5´5´目的基因变性加热5´5´引物退火5´5´底物延伸5´5´5´加热变性5´退火引物230个循环：230目标DNA片段达106-107变性－退火－延伸5´5´245´5´5´5´5´5´5´5´5´5´一个标准的PCR过程核酸的凝胶电泳基本原理当一种分子被放置在电场中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分子与支持介质的摩擦系数等。在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正种类：水平垂直琼脂糖聚丙烯酰胺普通DNARNA小分子量核酸二、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围:0.2-50kb凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000琼脂糖DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：核酸分子量的大小分子状态物理电压缓冲液温度电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。电泳染色剂：溴化乙锭(ethidiumbromide,简称EtBr)，扁平染料，嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。DNAMarker1.2kb800bp操作步骤成分贮液浓度使用量(20μl体系)水——14μl10×GCBufferMg2+Plus2μldNTPs2.5mmol0.5μl16Sp110pmol/μl1μl16Sp210pmol/μl1μl基因组DNA100μg/ml1μlTaq酶5U/μl0.5μl循环次数反应条件195℃（10min）3094℃；30s58℃；1min72℃；1min30s172℃；10min172℃(10min)操作步骤(1)称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需浓度的胶；10×TAE缓冲液配制：0.4MTris-乙酸；0.02MEDTA，pH8.0(2)置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；(3)按照每20ml胶加入1µlGoldview/20ml；(4)凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡，室温放置，至胶凝固；(5)小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE缓冲液的水平电泳槽中；(6)样品中加入1/5体积的6×loadingbuffer，混匀，用移液器小心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm)电泳；6×加样指示剂配方:0.25%溴酚蓝;40%(W/V)蔗糖水溶液；(7)取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。琼脂糖凝胶电泳：RibosomalRNASequences核糖体RNA序列与进化（1）具有重要且恒定的生理功能；（2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当的保守性；（3）分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)（4）高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。小核糖体亚单位RNA（16SrRNA，18SrRNA）引物方向序列（5′—3′）27f7-27正向GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG43f24-43正向TCAGAACGAACGCTGGCGGC519r519-536反向GWATTACCGCGGCKGCTG704f686-704正向GTACGGTGAARTGCGYAGA765r765-785反向CTGTTYGCTCCCCACGCTTTC926f917-926正向AAACTCAAAGGAATTGACGG1495r1495-1514反向CTACGGCTACCTTGTTACGA1541r1541-1556反向AAGGAGTGATCCAGCC对应于E.coli16SrDNA序列的位置16SrRNA的系统发育分析1AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGC61GGTAAGGCTCCTTCGGGAGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGTAATCTG121CCCTCCACTTTGGGATAAGCCTCGGAAACGAGGTCTAATACCGAATACGACCACTTCCTG181CATGGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTGGGGGATGTGCTCGCGGCCTATCAGCTTGT241TGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCC301ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC361AATGGGCGGAAGCCTGATCCAGCAACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAA421CCTCTTTCAGCGGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCCAACT481ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA541AAGGGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGGAGTGAAAACACCGGGCTTAACTCGGTGCTT601GCTTTCGATACGGGCAGACTAGAGGTATTCAGGGGAGAACGGAATTCCTGGTGTAGCGGT661GAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGAATATCCTG721ACGCTGAGGAGCGAAAGTGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACACCG781TAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGATCCATTCCACGGGTTCCGTGCCGCAGCTAACGCAT841TAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC901CCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGT961TTGACATACACCGGAAAGCTGCAGAGATGTAGCCCCTTTTAGTCGGTGTACAGGTGGTGC1021ATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC1081TCGTCCTATGTTGCCAGCAAGCCTTCGGGTGTTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGTC1141AACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCAC1201GCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATCCCGTGAGGGGGAGCGAATCCCAAAA1261AGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGT1321AATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC1381ACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTTGTGGAGGGAGCCGTC1441GAAGGTGGGGCTGGCGTTTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTA16SrRNA的系统发育分析NCBIBlast：://软件构建系统发育树FASTA格式文件找到刚才保存的文件实验结果1.电泳图片（表明样品名称和Marker分子量，目的片段大小）2.构件一个系统发育树