柑桔黄龙病病原16S rDNA克隆、测序及实时荧光 PCR检测方法的建立

*基金项目:国家质检总局植物病原检测专项（No.Z2000-3-182）。廖晓兰:女，1962年生，教授，在读博士。**通讯作者。Authorforcorrespondence.E-mail:[e-mail].收稿日期：2002-01-15接受日期:2002-03-18农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2004,12渊1冤院80~85·研究论文·柑桔黄龙病病原16SrDNA克隆、测序及实时荧光PCR检测方法的建立*廖晓兰1朱水芳2**赵文军2罗宽1漆艳香1陈红运2何昆1朱晓湘1(1.湖南农业大学植物保护学院,长沙410128;2.国家质检总局动植物检疫实验所,北京100029)摘要：克隆并测定了中国柑桔黄龙病病原16SrDNA基因序列，经同源性比较，表明属于柑桔黄龙病菌()亚洲种中一个新株系(中国厦门株系)。依据获得的16SrDNA特异序列，建立了柑桔黄龙病病菌检测的实时荧光PCR方法，并应用此方法对柑桔样品进行了检测。结果显示，该检测方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点。该方法为柑桔黄龙病的检测，特别是早期诊断、检疫和病害的综合治理奠定了基础。关键词：柑桔黄龙病病原;实时荧光PCR;16SrDNA检测;克隆CloningandSequencingofCitrusHuanglongbingPathogen16SrDNAandItsDetectionbyReal-timeFluorescentPCRLIAOXiao-Lan1ZHUShui-Fang2**ZHAOWen-Jun2LUOKuan1QIYan-Xiang1CHENHong-Yun2HEKun1ZHUXiao-Xiang1(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China;2.AnimalandPlantQuarantineInstitute,StateAdministrationofEntry-exitInspectionandQuarantineofChina,Beijing100029,China)The16SrDNAgeneofcitrusHunanglongbingpathogen()inChinawasclonedandsequenced.The16SrDNAoftheChinesepathogenwas99.8%and98.7%homogoustothoseofandThismeansthatthepathogenshouldbeanewstrainofdesignatedasChinaXiamenstrain.Areal-timefluorescentPCR(RTF-PCR)methodbasedonthe16SrDNAsequencewasestablishedtodetect.ItsprincipleisthatManprobesrelyingonfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)forquantitationareoligonucleotidesthatcontainafluorescentdye,typicallyonthe5'end,andaquenchingdye,typicallylocatedonthe3'end.Whenirradiated,theexcitedfluorescentdyetransfersenergytothenearbyquenchingdyemoleculewithoutfluorescing.TaqManprobesaredesignedtohybridizetoaninternalregionofaPCRproduct.DuringPCR,whenthepolymerasereplicatesatemplateonwhichaManprobeisbound,the5'exonucleaseactivityofthepolymerasecleavestheprobe.ThisseparatesthefluorescentandquenchingdyesandFRETnolongeroccurs.Fluorescenceincreasesineachcycle,proportionaltotherateofprobecleavage.UsingRTF-PCR,11plantsamplesweredetected.Thedescribedmethodhastheadvantageofhighspeed,sensitivity,specifityandstablereproductivity.Themethodcouldidentifythepathogenatearlystageofinfectioninthediseasedtreeswithoutanysymptom,itshouldbeinfavorofquarantineandcontrolofcitrusHunanglongbingdisease.citrusHuanglongbingpathogen;real-timefluorescentPCR;16SrDNAdetection;clone柑桔黄龙病是柑桔生产上的一个毁灭性病害，主要发生于亚洲、非洲的40多个国家，我国南部及西南部各省柑桔产区，受黄龙病危害甚为严重[1]。目前认为该病害是由原核生物薄壁菌门韧皮部杆菌属（）引起的，根据病原物对热的敏感性、虫媒和地理分布，分为亚洲种（）和非洲PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建期廖晓兰等：柑桔黄龙病病原16SrDNA克隆测序及实时荧光PCR检测方法的建立种（）。我国的柑桔黄龙病病原属于亚洲种[2]。由于病原菌属于难纯培养细菌，症状复杂，易与一些生理性病害混淆，植株感病后潜育期长，显症时，病树已濒临死亡。目前，主要以培育无病苗木和加强检疫以防止其传染与蔓延。因此对柑桔黄龙病的早期正确诊断对防治该病具有重要的意义。目前国内外对柑桔黄龙病的检测，除利用传统的生物学和生理生化方法，如指示植物法、电镜法、直接荧光诊断法、组织化学法[3]和单克隆法[4]①②外，也应用现代分子生物学方法进行检测，如rplKA-JL-rpoBC和nusG基因克隆、16SrDNA及16S-23SrDNA间区基因扩增、DNA-RAPD分析等[5]。常规检测方法耗时长、经验性强、特异性与灵敏度不高，而普通PCR需经如琼脂糖凝胶电泳、致癌物EB染色、Southern杂交等后续步骤验证。易造成污染和假阳性，同时也有损实验人员的健康。实时荧光PCR(real-timefluorescentPCR,RTF-PCR)是国际上最近发展起来的新技术，国外已开始应用于植物病害的诊断[6耀8]，本文作者曾报道用Man探针实时荧光PCR检测、鉴定不能培养的植物病原菌-植原体[9]。RTF-PCR是在普通PCR方法的基础上，加入了一条荧光标记的探针，利用荧光信号积累，实时监控整个PCR过程[9]。由于该方法使用了荧光探针，从而提高了检测的准确度和灵敏度，并且不需对PCR产物进行后续处理，可以有效的防止检测过程中的污染和假阳性，同时边扩增边检测，检测速度快，整个过程只需1耀2h。因此，实时荧光PCR目前被认为是植物病原鉴定和病害诊断的革新，将对植物病害诊断产生重大影响[10]。本研究的目的是在国内首次克隆柑桔黄龙病病原16SrDNA,并建立一种快速、准确和灵敏的检测鉴定柑桔黄龙病菌的实时荧光PCR方法。1材料和方法1.1材料1.1.1细菌及植原体表1中列出了本实验所用植原体及细菌的名单，均由国家出入境检验检疫局动植物检疫实验所植物检疫实验室提供。1.1.2植物样品植物样品分别采自福建厦门、广西永福县、广西灵山县、广西华山农场和湖南永洲市的田间柚(Macf.)和柑桔(Blanco)树黄化叶。1.2仪器和试剂1.2.1仪器PTC200PCR扩增仪(JMResearch),ABIPRISM7700扩增仪（PE公司），ALPHA5500型凝胶扫描仪（AlphaInnotech公司），Bechman紫外分光光度计（BECKMAN）,Biofuge28RS型台式冷冻离心机（BECKMAN）。1.2.2试剂DNA聚合酶,尿嘧啶DNA-糖苷酶(UNG酶),dATP、dUTP、dCTP、dGTP,PCR缓冲液,MgCl2等购自Promega公司,pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司.其它试剂为分析纯或生化试剂,水为灭菌双蒸水。1.3实验方法1.3.1实时荧光PCRDNA模板的制备根据文献[11]提供的方法。植原体DNA提取根据Lee等[11]的方法进行。植株中柑桔黄龙病菌DNA的提取，按CTAB抽提法[12]提取植物总DNA。1.3.2引物与探针的设计和合成16SrDNA扩增引物参照Jagoneix等[13]报道的引物序列合成,预期PCR产物为1167bp。P1:5'GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA3'；P2:5'GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT3'。实时荧光PCR的引物：BactF2:5'ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT3'；BactR2:5'CTACCAGGGTATCTAATCCT3'。为细菌广谱引物，来自细菌16SrDNA保守序列，所有细菌均可扩增出来，预期PCR产物为441bp。在BactF2/BactR2扩增片段区间找出柑桔黄龙病菌与所有细菌的稳定性突变点，应用引物和探针设计软件Primer5.0设计柑桔黄龙病菌的特异性探针HLprobe(探针已申请专利，故未列出序列)。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成，探针由上海申友生物技术有限公司合成。探针5'端标记报告荧光染料6-carboyfluorescein(FAM),3'端标记淬灭荧光染料（tetramethycarboxyrhodamine(TAMRA)。1.3.3实时荧光PCR反应体系：10伊PCR缓冲液①GaoSJ,GarnierM,BoveJM.ProductionofmonoclonalantibodiesrecognizingmostAsianstrainsofthegreeningBLObyimmunizationwithanantigenicproteinpurifiedfromtheBLO.MorenoP,DaGracaJV,JimmerLW.Proc,12thConf.Int,Org.CitrusVirol,Riversides,CA,1993,244~249②GarnierM,GaoSJ,HeYL,etal.Studyofthegreeningorganism(Go)withmonoclonalantibodies:Serologicalidentification,morphology,serotypesandpurificationoftheGo,BrlaskyRH,LeeRF,TimmerLW.Proc,11thConf,Int,Org,CitrusVirol,Riversides,CA,1993,428~43581PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建根癌土壤杆菌土壤杆菌