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健康食品安全性評估方法880802衛署食字第88037803號公告壹、前言為評估健康食品之安全性，依健康食品管理法第三條第二項規定訂定本方法。本方法規定健康食品安全性評估資料及毒性試驗項目及方法。貳、毒性試驗之規範一、試驗操作規範研發所需進行之非臨床試驗請參考衛生署87年6月29日公告之「藥品非臨床試驗優良操作規範」進行，並妥善保存所有觀察結果、原始數據及文書紀錄，以確保各項試驗數據之品質及試驗之完整性與可信度。二、安全性評估之分類健康食品之安全評估分為四個類別，主要係針對以往長期食用及製造加工之安全性作考量，故食用目的、方式、製造加工方法、流程、最終產品形式及攝食量等均為分類之考慮因素。各類之安全評估項目如下：第一類：屬下列二種情形之一者，得免再進行毒性測試。（一）產品之原料為傳統食用且以通常加工食品形式供食者。（二）產品具有完整之毒理學安全性學術文獻報告及曾供食用之紀錄，且其原料、組成成分及製造過程與所提具之學術文獻報告完全相符者。第二類：產品之原料為傳統食用而非以通常加工食品形式供食者，應檢具下列項目之毒性測試資料。（一）基因毒性試驗（二）28天餵食毒性試驗第三類：產品之原料非屬傳統食用者，應檢具下列項目之毒性測試資料。（一）基因毒性試驗（二）90天餵食毒性試驗（三）致畸試驗第四類：產品之原料非屬傳統食用且含有致癌物之類似物者，應檢具下列項目之毒性測試資料。（一）基因毒性試驗（二）90天餵食毒性試驗（三）致畸試驗（四）致癌性試驗（五）繁殖試驗三、毒性試驗之方法毒性試驗之方法包括下列六項：（一）基因毒性試驗（三）90天餵食毒性試驗（五）致癌性試驗（二）28天餵食毒性試驗（四）致畸試驗（六）繁殖試驗（一）基因毒性試驗(Genotoxicitystudy)基因毒性試驗可分為體內(invivo)與體外(invitro)測試，其目的為偵測試驗物質直接或間接引發的基因傷害及程度。一般基因毒性試驗有助於預測試驗物質的致癌性，且有助於致癌性試驗的結果分析。試驗物質須進行三種以上的基因毒性測試，包括：微生物基因突變分析，體外哺乳類細胞基因毒性分析，及動物體內基因毒性分析。依試驗物質的性質可增加其他的基因毒性測試(說明1)。１、微生物基因突變分析一般使用細菌基因突變測試法(genemutationinbacteria)。(1)菌株需使用下列5種菌株：1.S.typhimuriumTA982.S.typhimuriumTA1003.S.typhimuriumTA15354.S.typhimuriumTA1537、TA97、或TA97a5.S.typhimuriumTA102、E.coliWP2uvrA、或E.coliWP2uvrA(pKM101)註：4與5所列之三種菌株，分別擇一使用。(2)劑量範圍進行五個以上劑量組，最高劑量須足以產生明顯的毒性。毒性之產生可由初步試驗中逆突變的菌落(revertants)數量的減少測得。若試驗物質為高溶解度低毒性物質，最高劑量為5mg/plate，若試驗物質具有明顯的抗菌活性，則以產生抗菌活性的劑量作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質，則以產生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度，但不超過5mg/plate。(3)對照組對照組包含陰性對照組及陽性對照組(說明2)。(4)代謝活化(Metabolicactivation)進行含有及不含有S9混合物的測試(說明3)。(5)測試方法1.前置培養法(Preincubationmethod)，或2.平板混合試驗法(Plateincorporationmethod)(6)試驗結果每盤培養皿中突變菌落的數量，須以各測試點之平均值，再以表格方式詳細記錄。２、體外哺乳類細胞基因毒性分析一般使用體外哺乳類細胞的染色體異常分析法(InvitroChromosomalaberrationtestwithmammaliancellsinculture)或體外鼷鼠淋巴瘤tk分析法(Invitromouselymphomatkassay)。（1）體外哺乳類細胞的染色體異常分析法(Chromosomalaberrationtestwithmammaliancellsinculture)細胞使用哺乳類細胞株或初代哺乳類細胞。劑量範圍進行三個以上劑量組，劑量間隔可為2倍或自然對數對半(half-log)。依據初步試驗結果決定最高劑量，以試驗物質會造成50%以上之細胞生長抑制的濃度為最高劑量。若無觀察到細胞毒性，則以5mg/ml或10mM(以較低者為準)作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質，則以產生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度，但不超過5mg/ml或10mM。對照組對照組包含陰性對照組及陽性對照組(說明2)。代謝活化進行含有及不含有代謝活化系統的測試，如S9混合物(說明3)。實驗步驟i.細胞在試驗物質處理後之適當時機，製備染色體玻片。由於試驗物質可能會造成細胞週期延長，故須在一個適當間隔製備檢品。ii.每個劑量組製備兩片玻片，每片至少觀察100個分裂中期細胞，檢查染色體結構變異與多套染色體(polyploid)的數目。在描述細胞形態異常時，須註明染色體或染色分體的結構變異種類。試驗結果以表格方式描述染色體變異的種類及數量，並計算含染色體結構變異細胞之頻率。（２）體外鼷鼠淋巴瘤tk分析法細胞使用L5178YTK+/-鼷鼠淋巴瘤細胞株。劑量範圍進行三個以上劑量組，劑量間隔可為2倍或自然對數對半。依據初步試驗結果決定最高劑量，以試驗物質會造成80%以上之細胞死亡的濃度為最高劑量。若無觀察到細胞毒性，則以5mg/ml或10mM(以較低者為準)作為最高劑量。若試驗物質為低溶解度物質，則以產生最少沈澱物的濃度作為測試的最高濃度，但不超過5mg/ml或10mM。對照組對照組包含陰性對照組及陽性對照組(說明2)。代謝活化進行含有及不含有S9混合物的測試(說明3)。實驗步驟i.細胞在試驗物質處理後之適當時機，清洗去除試驗物質後，細胞繼續培養以測定其存活率，同時使細胞表現因試驗物質引發之致突變表現型(mutantphenotype)。ii.細胞經過適當的培養時間(足以表現引發之致突變表型)，細胞分別培養於含及不含嘧啶類似物培養液中，以測定其致突變數量(numbersofmutants)及細胞複製之效率(cloningefficiency)。嘧啶類似物如bromodeoxyuridine(BrdU)、fluorodeoxyuridine(FdU)或trifluorothymidine(TFT)等。試驗結果以表格方式描述每劑量組之細胞突變及存活之數目，同時計算細胞之存活率、複製效率及細胞致突變之頻率。３、動物活體基因毒性分析一般使用囓齒類動物造血細胞的染色體傷害分析法(Invivotestforchromosomaldamageusingrodenthematopoieticcells)。(1)動物一般使用雄性鼷鼠。若雄性與雌性動物在代謝或毒性上有明顯的差異時，則須同時使用雄、雌動物進行試驗。若試驗物質為特別針對某種性別時，則應使用該性別動物進行試驗。(2)動物數量每組至少五隻動物。(3)試驗物質給予途徑以腹腔注射或強迫餵食給予。(4)劑量範圍測試三個以上劑量組。若試驗需要，可由短期試驗之單一(或重覆)劑量投予試驗物質決定最高容許劑量，最高容許劑量即該劑量可引發骨髓毒性或其他明顯之毒性症狀，如抑制體重增加等，一般以最高容許劑量作為最高劑量。(5)對照組一般以試驗物質使用之溶劑作為陰性對照組，陽性對照組則給予會引發致突變物質。(6)試驗物質給予頻率單一或重覆劑量均可。(7)測試方法囓齒類骨髓細胞染色體異常測試法(Chromosomalaberrationsinbonemarrowcellsofrodents)囓齒類骨髓細胞之微核測試法(Micronucleiinbonemarrowcellsofrodents)囓齒類周邊血液之微核測試法(Micronucleiinperipheralbloodofrodents)(8)實驗步驟囓齒類骨髓細胞之染色體異常測試法i.經試驗物質處理的動物在適當時間犧牲，製備染色體玻片。由於試驗物質可能會造成細胞週期延長，故須在一個適當間隔製備檢品。ii.每個劑量組製備兩片，每片至少觀察100個分裂中期細胞，檢查染色體結構變異與多套染色體的數目。在描述細胞形態異常時，須註明染色體或染色分體的結構變異種類。囓齒類骨髓細胞或周邊血液之微核測試法i.經試驗物質處理的動物在適當時間犧牲，並製備骨髓或血液抹片。一般動物經試驗物質處理後一段時間(18到30小時)即犧牲並收集檢品，或在24到72小時內進行多次採樣製作樣本。若試驗需要，可經由短期預備試驗結果，選擇反應最明顯的時間採樣。ii.每隻動物至少觀察1000個多染性紅血球(polychromaticerythrocytes)或網狀紅血球(reticulocytes)，記錄微核發生的數目，同時計算多染性紅血球或網狀紅血球佔全部紅血球的比例。可採用Giemsa或Acridineorange螢光染劑之染色方法。可以觀察網狀紅血球的產生取代多染性紅血球。(9)試驗結果囓齒類骨髓細胞之染色體異常測試法以表格方式描述染色體變異的細胞總數，或每個細胞變異的頻率。囓齒類骨髓細胞或周邊血液之微核測試法以表格記錄多染性紅血球或網狀紅血球中微核發生的數目，及多染性紅血球或網狀紅血球佔全部紅血球的比例。說明1.基因毒性測試方法有：(1)以基因突變為參考指標的測試方法1.Genemutationtestwithbacteria2.Genemutationtestwithmammaliancellsinculture3.TestwithDrosophilamelanogaster4.Spottestwithmice5.Specificlocustestwithmice(2)以染色體變異做為參考指標的測試方法1.Chromosomalaberrationtestwithmammaliancellsinculture2.Chromosomalaberrationtestwithbonemarrowcellsofrodents3.Micronucleustestwithrodents4.Chromosomalaberrationtestwithgenocytesofrodents5.Dominantlethaltestwithrodents6.Reciprocaltranslocationtestwithmice(3)以基因受損為參考指數的測試1.Phageinductiontestwithbacteria2.DNArepairtestwithbacteria3.UnscheduledDNAsynthesistest(UDS)withmammaliancells4.Sisterchromatidexchange(SCE)testwithmammaliancells(4)其他測試1.Mitoticrecombinationandgeneconversiontestwithyeast2.Spermabnormalitytest2.一般以試驗物質使用之溶劑作為陰性對照組，而陽性對照組則依試驗具代謝活化與否之測試，加入適當的致突變劑(mutagens)。3.使用S9混合物(S9及coenzymes等)。S9製備方法為哺乳類動物(鼠)經藥物誘發代謝酵素處理後，自其肝臟萃取並經9000Xg離心而得的肝臟酵素。（二）２８天餵食毒性試驗(28-dayfeedingtoxicitystudy)28天餵食毒性試驗之目的是測試試驗物質經重覆給予28天後對哺乳類動物可能產生之毒性影響，了解毒性變化之產生，同時測定無毒性顯示之劑量(no-observed-adverse-effectlevel,NOAEL)。１、動物品種及性別囓齒類，最常使用的動物為鼠，雄、雌兩性動物的數量須相同，給予試驗物質之週齡為5-6週。２、動物數量每個劑量組使用雄、雌至少各10隻動物；若須進行試驗中期解剖或復原測