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ICS67.060CCSB20中华人民共和国粮食行业标准LS/T6147—2023粮油检测粮食中T-2毒素的测定时间分辨荧光免疫层析快速定量法Inspectionofgrainandoils—DeterminationofT-2toxinincereals—Time-resolvedfluorescentimmunochromatographicmethod2023-11-14发布2024-05-14实施国家粮食和物资储备局发布中国标准出版社出版前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由国家粮食和物资储备局提出。本文件由全国粮油标准化技术委员会(SAC/TC270)归口。本文件起草单位:江南大学、深圳市易瑞生物技术股份有限公司、深圳市绿诗源生物技术有限公司、江苏省粮油质量监测中心、南京微测生物科技有限公司、国家粮食和物资储备局科学研究院。本文件主要起草人:胥传来、郭玲玲、李爱科、匡华、刘丽强、王忠兴、徐丽广、付辉、黄永健、张鑫、蒋永青、黄斌、张金超、黄熙荣、黄伟。ⅠLS/T6147—2023粮油检测粮食中T-2毒素的测定时间分辨荧光免疫层析快速定量法1范围本文件规定了时间分辨荧光免疫层析快速定量法测定粮食中T-2毒素含量的试剂及材料、仪器设备、样品、样品测定、结果表述和重复性。本文件适用于玉米、小麦、稻米等粮食中T-2毒素的快速定量检测。本文件的方法检出限为3.0μg/kg,定量限为5.0μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样中T-2毒素与含铕-时间分辨荧光微球标记的特异性抗体发生结合后,抑制了层析过程中抗体与检测线上T-2毒素-蛋白偶联物的免疫反应,使检测线上荧光强度降低,通过荧光强度变化对应的荧光分析仪内置曲线自动计算出试样中T-2毒素的含量。5试剂及材料除另有说明外,所用试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682中三级水的要求。5.1试剂5.1.1T-2毒素(CAS:21259-20-1):纯度≥98%。5.1.2甲醇。5.1.3十水硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)。5.1.4硼酸(H3BO3)。5.1.5吐温-20(C58H114O26)。5.2T-2毒素荧光免疫层析卡(以下简称“检测卡”)性能应满足附录A的要求。不同品牌不同批次的检测卡使用前应按照附录A进行性能测定。1LS/T6147—20235.3溶液配制5.3.1样本提取液取50.0mL的甲醇(5.1.2)加水50.0mL,混匀,现用现配。由检测卡配套提供,或根据产品说明书配制。5.3.2样品稀释液称取19.07g十水硼酸钠(5.1.3)、12.37g硼酸(5.1.4)、50g吐温-20(5.1.5),用水溶解定容至1000mL,室温保存,有效期6个月。由检测卡配套提供,或根据产品说明书配制。5.4标准溶液配制称取1.0mg标准品T-2毒素(5.1.1),精确至0.01mg,用甲醇(5.1.2)溶解定容至10.0mL。此标准溶液中T-2毒素的含量为0.10mg/mL,-20℃条件下保存,有效期6个月。6仪器设备6.1天平:感量0.01g。6.2粉碎机:电机转速≥1000r/min。6.3检验筛:40目。6.4离心管:1.5mL、50mL。6.5涡旋振荡器。6.6离心机:转速≥5000r/min。6.7孵育器:37℃±3℃。6.8时间分辨荧光分析仪:激发波长为365nm±5nm,发射波长为615nm±5nm。6.9移液枪:200μL、1000μL。7样品7.1试样制备随机取样500g,粉碎后使其全部通过检验筛,充分混匀后,放入聚乙烯瓶或袋中。7.2试样储存将试样按照测试和备用分别存放,置于-18℃及以下条件下保存。8试验步骤8.1试样处理准确称取5.0g样品,精确至0.01g,倒入50mL离心管(6.4)中,加入25.0mL的样品提取液(5.3.1),用涡旋振荡器(6.5)振荡提取3min,然后用离心机(6.6)以5000r/min的转速在室温下离心3min。用移液枪(6.9)取100μL上清液加入已加有400μL样品稀释液(5.3.2)的1.5mL离心管中,涡旋混合,此溶液为待测溶液。2LS/T6147—20238.2孵育拆开产品包装,将T-2毒素检测卡放入孵育器(6.7),37℃下孵育5min。8.3检测用时间分辨荧光分析仪(6.8)读取相应磁卡曲线后进入测试界面,准确移取100μL待测溶液(8.1),加入检测卡加样孔中,37℃下反应6min后,立即将检测卡(5.2)放入时间分辨荧光分析仪(6.8)中进行检测,1min内读取数据。9试验数据处理9.1基于阴性对照样品,在5.0μg/kg~600μg/kg内,设置空白样品添加的不同浓度梯度。以添加T-2毒素浓度的对数值为横坐标、检测线T信号值与质控线C信号值的比值(T/C)为纵坐标,采用四参数logistic拟合算法建立标准曲线。拟合程度R2值应在0.99以上。9.2根据内置拟合曲线,试样中T-2毒素含量由时间分辨荧光分析仪自动计算并显示,单位为微克每千克(μg/kg)。检测结果在临界值时,应进行复验确认,复验方法应符合相关国家标准规定。10重复性在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的20%。3LS/T6147—2023附录A(规范性)T-2毒素时间分辨荧光免疫层析卡性能评价要求A.1概述本附录规定了时间分辨荧光免疫层析卡的技术性能要求,用于对时间分辨荧光免疫层析法检测类产品的技术性能进行验证,以确认其适用于本方法。A.2准确度采用高、中、低3个浓度水平的自然污染有证标准物质或采用国家标准方法定值的自然污染样品,用检测卡对每个浓度水平的标准物质或样品测试不少于6次,取平均值。计算检测卡检测结果的平均值与标准物质或样品定值的偏差。3个浓度水平的偏差均应在-20%~+10%之间。A.3重复性采用20μg/kg左右污染水平的自然污染有证标准物质或采用国家标准方法定值的自然污染样品,用检测卡测定不少于6次,计算检测卡批内变异系数。变异系数应小于或等于15%。A.4检出限计算20份阴性样品测定均值加3倍标准差,其结果应小于或等于产品灵敏度标示值。A.5批间稳定性采用20μg/kg左右污染水平的自然污染有证标准物质或采用国家标准方法定值的自然污染样品,用检测卡测定不少于6个批次,每个批次测定不少于2次,取批内测定平均值,计算批间变异系数。变异系数应小于或等于20%。A.6质控按照产品说明要求,检测检测卡自带的阴性质控和阳性质控样品。阴性质控的检测结果小于3μg/kg,阳性质控样品的检测结果在5μg/kg~600μg/kg范围内,表明检测卡质量合格。4LS/T6147—2023参考文献[1]GB/T27404—2008实验室质量控制规范食品理化检测5LS/T6147—2023