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食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定一、方法适用范围及原理亚硝酸盐采用盐酸萘乙二胺分光光度法测定，方法的检出限为1mg/kg,定量限为3mg/kg。硝酸盐采用镉柱还原法测定，方法的检出限为10mg/kg，定量限为30mg/kg。方法原理试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准系列比较定量。采用镉柱将硝酸盐还原成亚硝酸盐，测得亚硝酸盐总量，由此总量减去亚硝酸盐含量，即得试样中硝酸盐含量。二、实验准备（一）试剂配制（二）标准溶液的配制（三）主要仪器（四）镉柱（一）试剂配制试验用水应为蒸馏水、纯净水或去离子水，不能用自来水。购买试剂时要注意试剂名称和分子式是否与标准方法一致。例如：亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6.3H2O]、乙酸锌[Zn(CH3COO)2.2H2O]、硼酸钠[Na2B4O7.10H2O]、对氨基苯磺酸[C6H7NO3S]、盐酸萘乙二胺[C12H14N2.2HCL]氨缓冲溶液：量取30mL盐酸，加100mL水，混匀后加65mL氨水，再加水稀释至1000mL，混匀。调节pH至9.6～9.7（用PH计）。氨缓冲液的稀释液：量取50mL氨缓冲溶液，加水稀释至500mL，混匀。（二）标准溶液配制购买固体标准的，应注意亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸钠（NaNO3）均应为优级纯（GR），称量前，必须在硅胶干燥器中干燥24小时以上。购买液体标准溶液的，应注意其标示的浓度是以N计、以NO2-计、以NO3-计，最后结果均应换算成以NaNO2计。亚硝酸钠、硝酸钠标准储备溶液（200μg/mL，以NaNO2计）应置棕色瓶中5℃以下冷藏保存，有效期6个月。亚硝酸钠、硝酸钠标准使用液（5.0μg/mL、以NaNO2计）、必须临用前现配。（三）主要仪器小型绞肉机、粉碎机、匀浆机。天平：感量为0.1mg和1mg。分光光度计：2cm比色皿。镉柱（四）镉柱的制备投入足够的锌皮或锌棒于500mL硫酸镉溶液(200g/L)中，放置3h～4h。当镉全部被锌置换后，用玻璃棒轻轻刮下，取出残余锌棒，使镉沉底，倾去上层清液，以水用倾泻法多次洗涤（10次以上）。移入组织捣碎机中，加500mL水，捣碎约2s，用水将金属细粒洗至标准筛上，取20目～40目之间的部分（颗粒大小约同食用盐）。（四）镉柱的装填先用水装满镉柱玻璃管，然后装入2cm高的玻璃棉做垫，将玻璃棉压向柱底时，应将其中所包含的空气全部排出。在轻轻敲击下加入海绵状镉至8cm～10cm高，上面再用1cm高的玻璃棉覆盖，上置一贮液漏斗。当镉柱填装好后，先用25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL。镉柱不用时，必须用水封盖，随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。如无上述镉柱玻璃管时，可以25mL酸式滴定管代替。三、样品接收收样人应认真检查样品的包装和状态，若发现异常，应与送样人达成处理决定。送样量不能少于规定数量，至少不能少于测试用量的三倍。样品应编号登记，加施唯一性标识，保证不同检测状态和传递过程中样品不被混淆。四、样品的制备和保存（一）样品的制备（二）样品的保存（一）样品的制备已粉碎的样品（盐菜末等），应使用圆锥四分法（堆成圆锥体——压成扁平圆形——划两条交叉直线分成四等份——取对角部分）进行缩分。未粉碎的样品（腌咸菜、腌萝卜条等），应间隔一定的距离取多份小块四分法进行缩分。已切成片或块的禽肉类样品（排骨、鸡爪等），先室温解冻，四分法缩分。整块的禽肉类样品（腊肉、烤鸭等）在不同部位切取小片或截取小段四分法缩分。（一）样品的制备将缩分后的样品四分法分成二份，一份作留样备用（100g），另一份切细后用捣碎机捣碎混匀供分析(50g)。当送样量不能满足留样要求时，全部粉碎混匀，在保证分析样用量后，全部用作留样。样品应冷藏储运，在送达实验室后要尽快测定。蔬菜类样品应用食品塑料袋装好，在5℃以下冰箱冷藏保存。禽肉类样品应用食品塑料袋装好，在-18℃以下的冰柜或冰箱冷冻保存。（二）样品的保存五、试验步骤（一）试样前处理。（二）试剂空白制备。（三）标准曲线制备。（四）测定。（一）试样前处理硼砂饱和液作用：硼砂溶入水中，即被水解为等量的硼酸与硼酸二氢钠，起缓冲溶液作用。溶液pH约为9.18，即碱性。在碱性下处理样品有几方面作用：（1）是锌盐沉淀蛋白质时，要求在碱性。（2）是碱性下处理肉制品，脂肪被皂化，减少样品被脂肪包裹，使亚硝基根更易提取到水溶液中。（3）是溶液在碱性下亚硝基根以离子存在，易溶且稳定，如溶液偏酸性，则形成亚硝酸，在加热下容易挥发，也易分解，造成损失。（二）试剂空白制备于50mL烧杯中，加12.5mL硼砂饱和液，以70℃左右的水约300mL将试样洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加热15min，取出后冷却至室温。然后一面转动，一面加入5mL亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入5mL乙酸锌溶液。加水至刻度，摇匀，放置0.5h，清液用滤纸过滤，弃去初滤液30mL，滤液备用。（三）标准曲线制备（1）曲线至少作5个点（不包括空白）。（2）线性范围内相关系数应大于0.9990。（3）测试溶液中被测组分浓度必须在校准曲线的线性范围内。（四）测定亚硝酸盐测定（1）盐酸萘乙二胺溶液易变质，最好临用时新配。（2）用2cm比色杯，以零管调节零点，于波长538nm处测吸光度。（四）测定硝酸盐的测定（1）镉柱还原效率的测定（2）样品滤液经镉柱还原（3）亚硝酸钠总量的测定（1）镉柱还原效率的测定先用25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗2次，每次25mL,流速控制在3mL/min～5mL/min(1-2滴/秒)。吸取20mL硝酸钠标准使用液，加入5mL氨缓冲液的稀释液，混匀后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液。当贮液漏斗中的样液流完后，再加5mL水置换柱内留存的样液。（1）镉柱还原效率的测定将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于100mL容量瓶中，继以水流经镉柱洗涤三次，每次20mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀。得到还原后溶液为100mL。（1）镉柱还原效率的测定取10.0mL还原后的溶液（相当10μg亚硝酸钠）于50mL比色管中，加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以空白管调节零点，于波长538nm处测吸光度，代入标准曲线计算含量。（1）镉柱还原效率的测定还原效率计算：X=A×100/10X——还原效率，%A——由标准曲线计算测得的亚硝酸钠的含量，单位为微克（μg）10——测定用溶液中亚硝酸钠的含量，单位为微克（μg）（1）镉柱还原效率的测定还原效率大于98%为符合要求。若不符合要求，则继续用25mL盐酸(0.1mol/L)洗涤，再以水洗两次，每次25mL。实验过程中，随时保持镉柱在水平面以下，加液时沿贮液漏斗管壁匀速加入，避免镉柱内产生气泡。多次洗涤后，还原效率还不符合要求，应该重新制备装填镉柱。（2）样品滤液经镉柱还原先以25mL氨缓冲液的稀释液冲洗镉柱，流速控制在3mL/min～5mL/min（约1-2滴/秒）。吸取20mL滤液于50mL烧杯中，加5mL氨缓冲溶液，混合后注入贮液漏斗，使流经镉柱还原，以原烧杯收集流出液。当贮液漏斗中的样液流完后，再加5mL水置换柱内留存的样液。随时都要保持水平面在镉层之上，不得使镉层夹有气泡。将全部收集液如前再经镉柱还原一次，第二次流出液收集于100mL容量瓶中，继以水流经镉柱洗涤三次，每次20mL，洗液一并收集于同一容量瓶中，加水至刻度，混匀。（3）亚硝酸钠总量的测定吸取20mL还原后的样液于50mL比色管中，分别加入2mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3min～5min后各加入1mL盐酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混匀，静置15min，用2cm比色杯，以空白管调节零点，于波长538nm处测吸光度。代入标准曲线计算。六、结果计算试剂空白不为零时应扣除。样品溶液有颜色时，应先不加显色剂测定吸光度，再从加显色剂后测得的吸光度中扣除。亚硝酸盐含量结果应换算成以NaNO2计，并保留两位有效数字。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。六、结果计算硝酸盐含量的计算（以NaNO3计）X2=(X-X1)×1.232X2——试样中硝酸钠的含量，毫克每千克（mg/kg）；X——经镉柱还原后测得总亚硝酸钠的含量，毫克每千克（mg/kg）。X1——计算出的试样中亚硝酸钠的含量，毫克每千克（mg/kg）。1.232——亚硝酸钠换算成硝酸钠的系数；七、玻璃量器洗涤和干燥先用机械方法除去量器上的污染物，如用毛刷刷，或用水摇动(必要时可加入滤纸碎片)。油或油类物质可选用适当的溶剂去除，然后注入低泡沫洗涤液并用力摇晃（必要时可以超声）。若内壁仍不够清洁，可用下述洗液洗涤：（1）重铬酸钾-浓硫酸的混合液（100g/L）。（2）等量的30g/L的高锰酸钾溶液和1mol/L的氢氧化钠的混合溶液。然后用自来水冲洗，直至洗涤液全部冲净，再用纯水洗三次。一般洗净后的玻璃量器应自然风干。若急用，建议玻璃量器烘干温度不得超过150℃。Thankyou!2014.03.24