微生物鉴定技术在药品检验及监管中的应用

上海市食品药品检验所2010年5月27徐伟东微生物鉴定技术在药品检验和监管中的应用微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一一、背景介绍在1993-1998年间，美国FDA报告的由微生物污染引起的召回案件达到1370件，占所有产品召回案件的36%我国药品微生物污染的调查数据较少，但微生物污染仍居首位，近期披露的黑龙江完达山刺五加注射液受微生物污染的问题，已经造成了十分严重后果和无法挽回的损失。药品安全管理仍存在监管漏洞，造成定性难、溯源难、应变慢等问题，以及新的致病微生物或变异体的出现，导致药品受到微生物污染我国各大城市不断承办国际大型体育赛事和国际会议尤其是2010年在我国召开的上海世界博览会，也进一步增强了对药品的监督管理水平的要求。对微生物分类水平较低，只能鉴定到“属”，鉴定微生物种类有限传统微生物鉴定方法的局限分子方法分子生物学技术研究的是微生物DNA序列信息，常用于细菌分类的16SrDNA也有1500个碱基，每个碱基位置由ATGC四种核苷酸中的一种组成，多样性可达种可能（约）10900。新版的《伯杰氏系统细菌学手册》微生物DNA变异信息为主传统方法人类已知的土壤微生物已达到10万种现在常用的微生物鉴定用生化反应只有20多种，实际经过研究形成一致标准的、有意义的生化鉴定结果仅2000多种。微生物生化鉴定金标准的API鉴定系统——仅能鉴定550种细菌通过碳源利用进行微生物鉴定的Biolog系统也仅能鉴定2000种微生物微生物变异能力强，生化反应准确度不高，错检漏检现象普遍传统微生物鉴定方法的局限生化反应鉴定主要是利用不同微生物自身所特有的不同酶系统，根据微生物利用分解底物的种类和营养来源进行分类鉴定。在大多数情况下，同“属”微生物的酶系统基本相同，可以达到鉴定的目的微生物DNA突变能力强，如果这些突变点涉及到微生物酶系统的表达，就会造成酶活性降低甚至酶缺陷，导致鉴定失败在现行国家标准中，只有血浆凝固酶阳性反应才会被确证为金黄色葡萄球菌阳性，阴性反应的微生物则被作为无害菌处理。然而，近几年引起高度关注的血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌的流行使得金黄色葡萄球菌被漏检，血浆凝固酶阴性金黄色葡萄球菌往往含有肠毒素和其他毒素，是引起医院感染、社区食物中毒的重要污染源。不能对微生物污染进行准确溯源分析传统微生物鉴定方法的局限在进化过程中生物DNA分子会形成大量DNA多态性区域和非编码DNA序列。不会造成生物种属归类争议也不会造成任何形态上或酶系统表达的改变通过生化鉴定方法无法对这类变化进行有效的分析DNA位点变化却包含大量重要的微生物所独有的进化信息，可以与其他来源的同种微生物相区别，也是微生物种内差异的来源如常用于真菌种类鉴定的ITS基因ITS片段能保持相对稳定的变异频率亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一2.1技术手段2.2方法比较2.1技术手段2.2方法比较革兰氏染色镜鉴按照标准进行传统的生化反应鉴定API试剂条菌鉴定国际金标准半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）全自动细菌鉴定仪（VITEK2）微生物鉴定手段MiniVIDAS筛选系统免疫凝集/免疫沉淀实验微生物检测手段荧光定量PCR(BAX)分子生物学技术传统筛选方法2.1技术手段GenBankPCR基因分型分子杂交阳性菌分子水平上的鉴定12341.形态学鉴定3.核糖体水平上的鉴定APIVITEK16SrDNA序列分析分子杂交（DupontRiboPrinter）2.生化鉴定傅里叶红外光谱Rep-PCR(DiversiLab)4.全基因组水平上的鉴定5.脉冲场电泳技术(PFGE),多位点序列分析(MLST),多位点重复串联序列分析(MLVA),随机扩增多态性分析技术（RAPD)API试剂条——菌鉴定国际金标准无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴定，为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。特点：•完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于550种•简单方便：标准化方法，成本低廉，判读结果简单•快速结果：4-24小时。半自动细菌鉴定仪（ATBExpression）检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G（-）杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊度的菌液活化，于指定温度培养4小时/24小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较，以客观的2个参数（鉴定百分率及T-值）计算鉴定结果特点：速度快捷ATBExpression提供自动化接种，阅读及分析试条结果。准确可靠的结果ID32及快速ID32试条由金牌标准API试条改良而成，配合自动化概念，结合成完整的细菌鉴定系统全自动细菌鉴定仪（VITEK2）检测项目：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。可鉴定405种细菌，70多种药物约50多种药物组合的药敏卡。原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反应。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反应进行判断，利用数值法进行判定。特点：快速：鉴定结果平均只需4-6小时。对与快速生长细菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等)鉴定可提前到2小时。操作简便：全部操作自动化，简单而方便资料处理：bioLIAISON软件集中管理实验室资料获得AOAC国际认证：保证提供的微生物鉴定结果是公认的全自动荧光免疫分析仪(mini-VIDAS)检测项目：食品及环境中最常见致病性细菌（李斯特菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠杆菌O157、沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测）的快速筛检。原理：以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（ELFA）。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。特点：结果准确：对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美国FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。可同时进行12个相同或不同的测试。每天进行约60—80项测试特异性强：标本不需分离出目标微生物即可上机检测。避免交叉污染：没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染全自动化、操作简便荧光定量PCR聚合酶链式反应技术（PCR）是分子生物学技术最具有代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物DNA分子进行数百万倍放大的新型检测技术。荧光定量PCR技术在普通PCR技术基础上，通过荧光染料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通PCR的几百倍，并且整个扩增和检测过程由仪器自动完成，检测同量高，速度快，减少了人为误差和环境干扰因素，克服了普通PCR易污染的问题，除去样品前增菌时间，5小时内可得到检测结果。微生物检测限可能达到1CFU/mL以下，而且抗杂菌干扰能力强DNA测序技术DNA测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息如细菌的16SrDNA和真菌的ITS序列，已经被广泛测定应用于菌种鉴定研究之中。由于DNA测序方法耗时短，准确度高，在细菌、真菌、植物、动物的种类鉴定和系统发育研究方面得到了越来越广泛的应用a)微生物污染溯源分析目前微生物分型技术常用于流行病学调查和毒力分析国际上普遍认同脉冲凝胶电泳技术作为微生物分型的标准方法现代分子生物学技术可用来区别近缘种，并在研究微生物种内或种组间不同的污染来源及地理亲缘关系的研究中显示出广泛的应用前景b)相似微生物DNA序列比对和微生物进化分析根据生物DNA序列的特异性分析，可检测生物基因的微小变化，监控和预测微生物污染的爆发16SrDNA分型已被广泛认可，微生物16SrDNA进化树对目标微生物进行详细的基因分型，同时还可了解不同来源微生物的进化关系和亲缘关系。该技术应用范围宽，发展前景广，发展潜力巨大指纹图谱技术分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行酶消化，通过特异性探针与目标DNA序列的杂交结合，经过转膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。现有成熟的基于16SrDNA的分子杂技图谱库涵盖了200个属的1200多种6950株微生物，为各研究和实验机构提供了一个统一的微生物分型标准。为环境分离物、致病菌、有害生物体、质控菌株、有益生物体和任何细菌建立了一个全自动的基因指纹图库。这一精确到菌株水平的鉴定系统能够追溯细菌污染源，并且具有对所有微生物环境进行控制及流行病学调查等强大功能。a)近红外傅立叶光谱分析b)色谱分析物质成分分析红外傅立叶光谱分析FT-IR技术以未损伤细胞的FT-IR光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征由于这些细胞组分与基因表达有关，反应了全细胞组分的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息，从而区分生化信息上的差别德国Bruker公司微生物FT-IR分析用户手册主要采用1200-900ｃｍ-1，3000-2800ｃｍ-1，1500-1400ｃｍ-1谱段组合进行微生物判别分析，这3个谱段分别主要代表了微生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成分的信息。色谱分析微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径高效液相色谱(High-performanceliquidchromatography，HPLC)气相色谱(Gaschromatography，GC)气相色谱质谱联用(Gaschromatography-massspectrometry，GC-MS)液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是色谱分析微生物的主要方向2.1技术手段2.2方法比较各种鉴定方法的比较我所抗生素室通过比较分析近百种微生物的生化鉴定方法（API和VITEK2鉴定）和分子生物学方法鉴定方法，客观准确的多方面评价各种方法的优劣微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一3.1细菌鉴定3.2溯源分析3.1细菌鉴定3.2溯源分析3.1细菌鉴定3.2溯源分析微生物鉴定技术平台的建设二样品微生物的鉴定及同源性分析三微生物实验室能力建设微生物新技术的应用四微生物污染监管方式的思考五背景介绍一四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.34.4四、微生物鉴定技术平台建设的意义及运用增强药品中微生物检验能力，做到数据可信，国际认可，为执法、仲裁提供依据政府检测实验室、药厂微生物检测实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力与国际标准接轨，监控药品生产环境，构建药品生产微生物风险评估体系应用范围广，扩展能力强，医疗器械、食品、医院等领域广泛运用4.14.24.