DB11T 2023-2022 鱼类贝类环境DNA识别技术规范

ICS13.020.01CCSZ01DB11北京市地方标准DB11/T2023—2022鱼类贝类环境DNA识别技术规范TechnicalregulationsforfishandshellfishidentificationusingenvironmentalDNA2022-09-29发布2023-01-01实施北京市市场监督管理局发布DB11/T2023—2022I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14鱼类贝类eDNA识别程序..............................................................25试剂和器具.........................................................................26水样采集...........................................................................47水样富集...........................................................................58DNA提取和纯化.....................................................................59PCR扩增...........................................................................610测序及结果分析....................................................................711质量保证与质量控制................................................................8附录A（资料性）8碱基条形码参考序列...............................................9参考文献.............................................................................10DB11/T2023—2022II前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由北京市水务局提出并归口。本文件由北京市水务局组织实施。本文件起草单位：北京市水文总站（北京市水务局水质水生态监测中心）、中国科学院生态环境研究中心、首都师范大学。本文件主要起草人：黄振芳、刘波、杨蓉、李世国、王忠锁、王东霞、徐斌、赵红磊、叶燕慧、郭伟、徐冉、唐女、孙春媛、张满富、吕喆、王浩、王玉璠、吴玉梅、王雪莲、刘芳、焦振寰、陶亮、薛晨旺。DB11/T2023—20221鱼类贝类环境DNA识别技术规范1范围本文件规定了鱼类贝类环境DNA（eDNA）识别的对象、技术方法、采集和实验分析等技术要求。本文件适用于河流、湖泊、水库和渠道等地表水域的鱼类和贝类eDNA识别。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SL219水环境监测规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1鱼类fish以鳃呼吸、凭上下颌摄食并通过尾和躯干摆动以及鳍的协调作用游泳的水生脊椎动物，是软骨鱼纲和硬骨鱼纲动物的统称。3.2贝类shellfish具三胚层、真体腔的软体动物，为底栖动物中的重要功能类群，主要包括双壳类（如蚌类、贻贝）和腹足类（如螺类）。3.3环境DNAenvironmentalDNA(eDNA)从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNA，可提供一个环境中生活物种的存在记录。3.4聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，包括变性、退火、延伸等主要步骤。DB11/T2023—202223.5分类操作单元operationaltaxonomicunit(OTU)在系统发生学或群体遗传学研究中设定的特定标志，可鉴别生物分类单元（品系、种、属等）。一般把碱基序列相似度不小于97%的OTU定义为一个物种。3.6引物条形码barcode为高通量测序时区分不同样点来源的物种基因序列，在扩增引物5’端增加的序列特异性短片段标记。4鱼类贝类eDNA识别程序鱼类贝类eDNA识别程序见图1。图1鱼类贝类eDNA识别程序5试剂和器具5.1试剂除非另有说明，试剂均使用符合国家标准的分析纯试剂，试验用水均使用满足GB/T6682中一级水要求的新制备的超纯水。具体要求如下：——次氯酸钠：化学纯；——消毒液：次氯酸钠和蒸馏水配制，有效氯浓度5.5%~6.5%（质量分数）；DB11/T2023—20223——无水乙醇：化学纯，分析纯；——75%乙醇：无水乙醇和超纯水3:1配制，其中消毒用75%乙醇可使用化学纯无水乙醇和蒸馏水3:1配制；——70%乙醇：无水乙醇和超纯水7:3配制；——乙二胺四乙酸（EDTA）；——氢氧化钠（NaOH）；——EDTA溶液，ρ（EDTA）=0.02mol/L：称取5.8448gEDTA溶于适量超纯水中，NaOH固体调节pH至8.0，定容至1000mL，121℃灭菌18min，冷却后常温保存；——EDTA溶液，ρ（EDTA）=0.5mol/L：称取14.612gEDTA溶于适量超纯水中，NaOH固体调节pH至8.0，定容至100mL，121℃灭菌18min，冷却后常温保存；——三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）；——浓盐酸；——Tris-HCl溶液，ρ（Tris-HCl）=0.1mol/L：称取15.76gTris-HCl溶于适量超纯水中，浓盐酸调节pH至8.0，定容至1000mL，121℃灭菌18min，冷却后常温保存；——十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；——氯化钠（NaCl）；——CTAB提取液：称取4gCTAB和16.38gNaCl，分别溶于适量超纯水中，加入0.02mol/LEDTA溶液8mL和0.1mol/LTris-HCl溶液20mL，定容至200mL，121℃灭菌18min，冷却后常温保存；——蛋白酶K：酶活力单位为20；——Tris饱和酚，pH7.8；——氯仿；——异戊醇；——酚氯仿：Tris饱和酚、氯仿和异戊醇按25:24:1体积比配制；——乙酸铵（CH3COONH4）；——乙酸铵溶液，ρ（CH3COONH4）=7.5mol/L：称取5.78g乙酸铵溶于10mL超纯水中；——乙酸钠（CH3COONa·3H2O）；——乙酸钠溶液，ρ（CH3COONa）=3mol/L：称取102.06g乙酸钠溶于适量超纯水中，冰醋酸调节pH至5.2，定容至250mL，分装后121℃灭菌18min；——动物组织细胞DNA提取试剂盒：主要包括样品裂解液、DNA沉淀试剂、DNA洗涤试剂、DNA溶解试剂、纯化柱等，提取的DNA要求OD260/280比值介于1.8~2.0之间，OD260/230比值大于2.0；——柱式PCR产物纯化试剂盒：主要包括DNA溶解试剂、纯化柱、DNA沉淀试剂、DNA洗涤试剂等，纯化的DNA要求OD260/280比值介于1.8~2.0之间，OD260/230比值大于2.0；——PCR聚合酶：碱基错配率低于10-6；——脱氧核糖核苷三磷酸：脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟嘌呤三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸的等摩尔数混合物（各2.5×10-3mol/L），纯度98%；——三羟甲基氨基甲烷（Tris）；——硼酸；——Tris-硼酸电泳缓冲液（TBE，5×）：称取54gTris和27.5g硼酸溶于适量超纯水中，加入0.5mol/LEDTA溶液20mL，定容至1000mL，121℃灭菌18min，冷却后常温保存；——琼脂糖：电泳级；——溴化乙锭（EB）；DB11/T2023—20224——2.0%琼脂糖凝胶：量取5×TBE缓冲液20mL，加入超纯水180mL和4g琼脂糖，加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，待琼脂糖胶液冷却至50℃~60℃时加入0.1mgEB，倒入电泳槽中，待胶完全冷却凝固后备用；——DNA分子量标准品：范围0~100bp。5.2主要器具具体要求如下：——车载冰箱：温控4℃及以下；——采样瓶：1L，塑料或玻璃材质，具螺旋帽或磨口塞，使用前121℃灭菌18min；——微量移液器：0.2µL~2µL、1µL~10µL、20µL~200µL、100µL~1000µL；——真空抽滤泵及过滤砂芯；——冰箱：温控-20℃；——高压蒸汽灭菌器：可达到标准要求的121℃及18min灭菌条件；——混合纤维素酯滤膜：孔径0.45μm；——手术剪；——尖头镊子；——离心管：1.5mL，无DNA酶；——PCR管：200µL；——超微量紫外分光光度计：最小测量体积不高于1µL，波长范围包括230nm、260nm和280nm，检出限2ng/μL(dsDNA)；——PCR仪：温控范围0~100℃℃，升温速度6/s℃，配套PCR管200µL；——低温离心机：最高离心转速不低于13000rpm，温控范围低至4℃；——凝胶成像分析系统：302nm光源；——电泳仪：水平式；——电泳槽：水平式。6水样采集6.1采样点设置eDNA采样点的布设应遵循以下原则：a)主要考虑不同植被覆盖、水文条件和底质特征设置样点，兼顾近岸浅水水域和离岸开阔水域；b)湖泊型水体：每2km2设置不少于1个采样点；c)水库型水体：入库河口区应设置采样点，库区每15km2~20km2设置不少于1个采样点；d)河流型水体：参照SL219中水质监测断面布设原则设置采样断面；对鱼类eDNA样品，在采样断面上、中、下游间隔500m以上等比采集混合水样；对贝类eDNA样品，河流宽度50m时在两岸近岸水域布设2个采样点，河流宽度≥50m时在两岸近岸水域和中间共布设3个采样点，等比采集混合水样。6.2采集方式6.2.1近岸样点：鱼类eDNA样品在距岸5m内、不受泥沙干扰的区域采集，贝类eDNA样品在距岸0.5m处采集。采样人佩戴一次性乳胶手套，将1L的灭菌采样瓶瓶口向上游来水方向，在距水面下0.5m范围内采集1L水样。DB11/T2023—202256.2.2离岸样点：鱼类eDNA样品在水深10m处水面下0.5m采集，水深≥10m处分水面下0.5m和水底上1m两个水层等比采集混合水样；贝类eDNA样品在水底上0.5m范围内采集。采样人乘船于船行进方向前侧用采水器采集1L水样，转移至灭菌采样瓶中。6.2.3采样瓶装满后应密封并做好标记，置于车载冰箱4℃冷藏运输。7水样富集7.1器具消毒7.1.1宜根据样品数准备足量器具，统一消毒备用。7.1.2抽滤器和废液瓶需用自来水冲洗，并置于消毒液中浸泡30min，取出用自来水冲净后超纯水浸洗10min，烘干备用。7.1.3剪刀和镊子用自来水和75%乙