DB11T 1461.5-2018 实验动物繁育与遗传监测 第5部分：实验用长爪沙鼠

ICS65.020.30B44备案号：60724-2018北京DB11市地方标准DB11/T1461.5—2018实验动物繁育与遗传监测第5部分:实验用长爪沙鼠LaboratoryanimalBreedingandgeneticcontrolPart5:ExperimentalMongoliangerbil2018-09-29发布2019-01-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T1461.5—2018目次前言..........................................................................................Ii范围.........................................................................................12规范性引用文件..............................................................................13术语定义.....................................................................................14遗传分类及命名..............................................................................15实验用长爪沙鼠的繁育方法...................................................................26实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量监测........................................................2附录A(规范性附录）封闭群实验用长爪沙鼠微卫星DNA标记遗传检测方法.................4IDB11/T1461.5—2018刖言DB11/T1461《实验动物繁育与遗传监测》拟分为以下部分:一一第1部分：实验用猪；一一第2部分：实验用牛；一一第3部分：实验用羊；一一第4部分：实验用狨猴；一一第5部分：实验用长爪沙鼠；本部分为DB11/T1461的第5部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由北京市科学技术委员会提出并归口。本部分由北京市科学技术委员会组织实施。本部分起草单位：首都医科大学、中国食品药品检定研究院、浙江省医学科学院。本部分主要起草人：陈振文、杜小燕、李长龙、岳秉飞、贺争鸣、萨晓婴、巩薇、郭红刚IIDB11/T1461.5—2018实验动物繁育与遗传监测第5部分：实验用长爪沙鼠1范围本部分规定了实验用长爪沙鼠的繁育和繁殖种群的遗传监测。本部分适用于实验用长爪沙鼠的繁育和遗传监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14923实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制3术语定义下列术语和定义适用于本文件。1实验用长爪沙鼠experimentalMongoliangerbil经人工饲育，对其携带的病原微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产和检定以及其他科学实验的长爪沙鼠。封闭群closedcolony以非近亲交配方式进行繁殖生产的实验用长爪沙鼠种群，在不从外部引入新个体的条件下，至少连续繁殖4代以上称为封闭群，亦称远交群。4遗传分类及命名4.1遗传分类根据遗传结构特点，实验用长爪沙鼠为封闭群。4.2命名4.2.1封闭群命名封闭群命名由由2〜4个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母应大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母。保持者与种群名称之间用冒号分开。示例：CmuCMU表示由首都医科大学（Cmu)保持的CMU实验用长爪沙鼠封闭群。Z:ZLAC表示由浙江省医学科学院（Z)保持的ZLAC实验用长爪沙鼠封闭群。1DB11/T1461.5—20185实验用长爪沙鼠的繁育方法5.1原则封闭群实验用长爪沙鼠繁殖方法应以保持封闭群动物的遗传概貌和生理特征，避免近交繁殖为原则。5.2引种繁殖用实验用长爪沙鼠应遗传背景明确或来源清楚，有较完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）。保持封闭群实验用长爪沙鼠的遗传异质性及基因多态性，引种动物数量要足够多。为控制引种数量，可以根据后代繁殖方式，在保证每代近交系数増量不大于1%的前提下，决定引种群规模，引种数目参照GB14923执行。实验用长爪沙鼠最小引种群规模为25对，种用动物应三代以内无共同亲代。5.3繁殖保持封闭群实验用长爪沙鼠遗传基因的稳定，种群应足够大，并尽量避免近亲交配。具体繁殖方法参照GB14923执行。6实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量监测6.1实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量要求封闭群实验用长爪沙鼠应符合以下要求：a)具有明确的遗传背景资料或来源清楚，有完整的资料（包括种群名称、来源、遗传基因特点及主要生物学特性等）；并能充分表明新培育的或引种的封闭群实验用长爪沙鼠符合封闭群定义的规定；b)用于封闭群保种及生产的繁殖记录应清楚完整，繁殖方法科学合理；c)经遗传检测（微卫星DNA检测方法等）质量合格。6.2实验用长爪沙鼠封闭群的遗传质量检测方法及实施6.2.1检测方法采用微卫星DNA标记检测方法进行，具体方法见附录A。6.2.2抽样随机取实验用长爪沙鼠的血液或其他组织，按表1要求从每个封闭群中随机抽取非同窝成年实验用长爪沙鼠，雌雄各半。采样数量按表1进行。2表1封闭群实验用长爪沙鼠遗传检测采样数量DB11/T1461.5—2018单位为只群体大小抽样数量少于100应不少于15不少于100应不少于306.2.3群体评价群体内遗传变异采用平均杂合度或群体平衡状态方法进行评价，按附录A中A.6执行。6.2.4检测频率封闭群实验用长爪沙鼠群体12个月至少进行一次遗传质量检测。3附录A(规范性附录）封闭群实验用长爪沙鼠微卫星DNA标记遗传检测方法A.1仪器设备遗传分析仪，4°C、-20°C冰箱，低温高速离心机，水浴锅，感量为0.0001g的分析天平，pH计，紫外分光光度仪。A.2基因组DNA的提取用酚-氯仿萃取法或试剂盒提取基因组DNA。A.3微卫星位点用于检测实验用长爪沙鼠遗传质量的微卫星位点为28个，各微卫星位点的名称、引物序列、等位基因数、PCR反应的Tm值见表A.1。DB11/T1461.5—2018A.4PCR扩増A.4.1PCR扩增的体系PCR总反应体积为15uL，其中含10XPCRbuffer:1.5uL，上下游引物（100pmol/uL)各1uL，4XdNTP100umol/L:1uL，Taq酶1U:1uL，50ng〜100ng基因组DNA:1uL，纯水（ddH20):8•5uL。PCR反应程序为：95C预变性，4min;94C变性，30s;退火温度（各位点序列、PCR反应条件参见表A.1)，30s;72C延伸，30s;35个循环；72C继续延伸7min;扩増产物4C保存。A.4.2PCR产物的凝胶检测PCR产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩増结果。A.4.3扩增产物的STR扫描扩増产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩増出目的片断后，选择分别以FAM、HEX、TAMRA标记的三个位点的扩増产物，以1:3:5体积比混合，取1uL上样进行STR扫描。A.5STR扫描结果的判读与统计分析A.5.1STR扫描结果的判读扫描结果可出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合基因型，有两个主波。由群体遗传分析软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩増片断大小。每个位点的等位基因根据扩増片断从小到大顺序排列记录为Akhd…等。A.5.2运用群体遗传分析软件对数据进行统计分析4DB11/T1461.5—2018将所有样本的每个微卫星位点的基因型以ab,bb…等形式运用软件的数据文件，计算样品在各微卫星位点上的基因频率、平均观察等位基因数、平均有效等位基因数（Ne)、香隆指数、平均杂合度（H)等。A.6结果判定群体内遗传变异采用平均杂合度或群体平衡状态方法进行评价。当用杂合度来判定时，当平均杂合度在0.5〜0.7时，群体为合格的封闭群群体。当用群体是否达到平衡状态来判定时，按照哈代-温伯格（Hardy-Weiberg)定律，根据各位点的等位基因数计算封闭群的基因频率，进行卡方（chi-squaretest)检验。如果没有达到平衡状态，说明群体的基因频率或基因型频率发生变化，该封闭群群体判为不合格。A.7结果报告根据判定结果对封闭群实验用长爪沙鼠群体出具遗传质量检测报告。表A.1实验用长爪沙鼠微卫星位点的引物序列、最佳扩增温度、等位基因数及等位基因分布范围位点引物序列（5'-3〇Mg2+浓度（mM)退火温度(°C)等位基因数等位基因分布范围AF200942CAGGCACCCCCAGTTTGTCTACACAGGCTGAGGATGT2.05415180-215AF200943GGCTCCTGATTCTACATTTCTCAACCATTGGCAACTCTC2.05717154-181AF200944GCTGGGCTTTAATGTTTATTTGGTGGCTCACACTTTCTGT2.05419113-134AF200946TTTCTGGGGTCTCTTTCTCTCCCATTCTGCAAGACTCCTCT2.05728195-242AF200945AGTCCCTATTACATCCACAAGTTATCCTGCAAAGCCTAAG2.05712166-186AF200941TGGGTCCTTTGGAAGATGGCTTAAAATGAATCACTTA2.05524115-153AF200947GACAGAGTGGGAGGGGTATGTTGGCAAGTTTGGTTTGTTTGA2.05517188-212D16Mit7CTGCCACCCCTGAACCATTACTACAAGATGTGGGGCATGA2.052.615480-529D16Mit26CAGGAATAAAGTATAATGGGGTGCCCCATGATCAGTTGGGTTTT2.049.19207-266D1Mit362TGTGTGACTGCTTGGAAGATGCTGAGTCCCTAAAGTTGTCCTTG1.550.016476-504D8Mit184GTTTTTCTCAGAAGAATGCAATATACCTGAGAAGAATGAGGAATTTGTCC2.048.111196-2295DB11/T1461.5—2018表A.1实验用长爪沙鼠微卫星位点的引物序列、最佳扩增温度、等位基因数及等位基因分布范围（续)位点引物序列（5'-3〇Mg2+浓度（mM)退火温度(°C)等位基因数等位基因分布范围D7Mit33TCTGAAGTTTGAATGGTTGTGGTTTCAAAATCGTGTCATTTTGC2.047.315376-394D6Mit37AAAGAATTGCACATCCACTGGTGCCCAGGATGTTTAAGAGG2.047.014246-265D5Mit31TCAGGGCTCTCTAAGGGACAACTATGCAGCCACCAAATCC2.053.19318-350D12Mit201CCACTGGATGGCAACAGACTATGTGTTTCAAAACCACACTCG2.053.118245-283D2Mit22GCTCCCTTTCCTCTTGAACCGGGCCCTTATTCTATCTCCC2.049.19173-192D15Mit124AGGAGAGAACCAACTGCTGCGGCCAGTGATGACTTTATAATGC2.559.817232-258