DB11T 1397-2017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程

ICS65.150B50备案号:54176-2017DB11北京市地方标准DB11/T1397—2017鱼类口服抗菌药物选用技术规程Thetechnicalprotocolofscreeningoralantibacterialsforfish2017-03-22发布2017-07-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T1397—2017I前言本标准根据GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由北京市农业局提出并归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：王小亮、王静波、王姝、曹欢、张文、王澎、徐立蒲、那立海。DB11/T1397—20171鱼类口服抗菌药物选用技术规程1范围本标准规定了鱼类口服抗菌药物选用原则、程序和操作流程。本标准适用于养殖鱼类细菌感染判断和治疗时口服抗菌药物选用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27623.1—2011渔用抗菌药物药效试验技术规范第1部分：常量肉汤稀释法药物敏感性试验SC/T7014—2006水生动物检疫实验技术规范SC/T7201.1—2006鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术3药物选用原则和程序3.1原则抗菌药物使用应遵循以下原则：——药物种类应符合国家有关标准，药品应获得国家批准文号；——选择GMP认证企业生产的抗菌药物；——使用的优先顺序是磺胺类＞四环素类＞氨基糖苷类＞氟喹诺酮类＞酰胺醇类。3.2程序鱼类口服抗菌药物的选用程序参见附录A。4操作流程4.1病鱼采集病鱼采集按SC/T7014—2006第6章的规定进行。4.2病原菌的分离病原菌的分离参见附录B。附录B中的BHIA的培养基配方参见C.1。4.3细菌感染判断任何一个划线分离平板，线上有菌落或菌带，则该样品来源养殖池塘的鱼类宜用口服抗菌药物；反之，则不必使用。DB11/T1397—201724.4敏感药物筛选采取纸片扩散法（参见D.3）筛选敏感药物种类。依检测结果选择敏感药物种类，原则如下：——一个样品仅获得一株病原菌，选择该菌的敏感药物种类；——一个样品获得多株病原菌，选择共同的敏感药物种类；——一个样品获得多株病原菌，且无共同的敏感药物种类，选择内脏器官分离菌的敏感药物种类，优先选取肝、肾分离菌的敏感药物种类。4.5用药剂量确定4.5.1检测病原菌的最小抑菌浓度（MinimumInhibitoryConcentration，MIC）采用浓度梯度稀释法（参见D.4）检测其对样品所有病原菌的MIC值。4.5.2计算样品每千克鱼的日用药剂量按4.5.1检测样品所有病原菌的MIC值，同种药物选取最大的MIC值。每种敏感药物按公式（1）计算样品每千克鱼的日用药剂量，每千克鱼的日用药剂量不超过国家兽药规定的使用许可值。r¸´=SMICU.....................................(1)式中：U——每千克鱼的日药物使用剂量（指有效成分剂量），单位为毫克每千克（mg/kg）；MIC——抗菌药物对病原菌的MIC值，单位为毫克每升（mg/L）；S——系数，鲤科鱼类为8.1，冷水鱼类为9.4，养殖者可依经验微调该系数；r——水的密度，数值约为1，单位为千克每升（kg/L）。4.5.3计算样品池塘的日药物总使用剂量每种敏感药物按公式（2）计算样品池塘的日总用药剂量。1000¸´=TUM....................................(2)式中：M——样品池塘的日药物总使用剂量（指有效成分剂量），单位为克（g）；U——每千克鱼的日药物使用剂量（指有效成分剂量），单位为毫克每千克（mg/kg）；T——样品池塘养殖鱼类的总重量，单位为千克（kg）。4.6使用方法将样品鱼来源池塘的饵料日投喂量减少一半。将4.5.3确定的日药物总使用剂量溶解拌入饵料中，充分混匀，一次性投喂使用。4.7用药效果评价用药后，按以下原则判断用药效果：——如用药后3d～5d，日死亡数量明显下降或疾病的症状改善甚至消失，则认定药物治疗有效；——如用药后3d～5d，鱼的日死亡数量保持治疗前的水平或者超过治疗前的水平，则认定药物治疗无效。DB11/T1397—20173AA附录A（资料性附录）鱼类口服抗菌药物选用程序图A.1鱼类口服抗菌药物选用程序示意是否发病池敏感药物筛选用药剂量确定使用方法病鱼不用抗菌药物治疗及用药效果评价平板线上是否有菌落或菌带病鱼采集病原菌的分离DB11/T1397—20174BB附录B（资料性附录）病原菌的分离B.1设备和材料B.1.1普通天平：0g～210g，精确至0.01g。B.1.2高压灭菌锅。B.1.3微波炉。B.1.4生物安全柜或超净工作台。B.1.5生物显微镜：×10，×40，×100。B.1.6培养皿：直径90mm。B.1.7酒精灯、解剖盘、解剖刀、剪子、镊子、接种环（针）、三角烧瓶（500mL）等。B.1.8试剂和培养基B.1.9水：GB/T6682，二级。B.1.10脑心浸液琼脂（BrainHeartInfusionAgar,BHIA）：参见C.1。B.2取样部位病灶、肝、肾、脾、性腺、脑。B.3病原菌分离B.3.1冷水鱼病原菌分离用接种环从取样部位蘸取病料，无菌操作划线接种于BHIA平板，22℃±2℃培养24h～48h，无菌生长时继续培养至5d。B.3.2温水鱼病原菌分离用接种环从取样部位蘸取病料，无菌操作划线接种于BHIA平板，28℃±2℃培养24h～48h，无菌生长时继续培养至5d。DB11/T1397—20175CC附录C（资料性附录）培养基的配制方法C.1脑心浸液琼脂（BHIA）C.1.1成分牛脑浸粉12.5g牛心浸粉5.0g蛋白胨10.0g葡萄糖2.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠2.5g琼脂10g蒸馏水1000mLC.1.2制法将C.1.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.4±0.1，121℃高压灭菌20min，冷至50℃左右，倾制平板。C.2水解酪蛋白琼脂（MHA）C.2.1成分牛肉浸膏6.0g酸水解酪蛋白胨17.5g可溶性淀粉1.5g琼脂17.0g蒸馏水1000mLC.2.2制法将C.2.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.3±0.1，121℃高压灭菌15min，冷至50℃左右，倾制平板。平板中的培养基厚度4mm。C.3水解酪蛋白肉汤（MHB）C.3.1成分牛肉浸膏6.0g酸水解酪蛋白胨17.5g可溶性淀粉1.5gDB11/T1397—20176蒸馏水1000mLC.3.2制法将C.3.1中各成分混匀，加热溶解，调pH至7.3±0.1，121℃高压灭菌15min。如检测链球菌，临用前加无菌血清0.5%。DB11/T1397—20177DD附录D（资料性附录）病原菌的药物敏感性检测D.1设备和材料D.1.1恒温培养箱：0℃～60℃。D.1.2精密天平：精确至0.0001g。D.1.3高压灭菌锅。D.1.4比浊仪。D.1.5生物安全柜或超净工作台。D.1.6生物显微镜：×10，×40，×100。D.1.7微量移液器：100μL～1000μL，10μL～100μL。D.1.8多通道移液器：50μL～300μL。D.1.9培养皿：直径90mm。D.1.10试管、试管架：15mm×150mm，15mm×100mm。D.1.11微孔板（≥500μL/孔）。D.1.12一次性针头过滤器（≤0.22μm）、注射器（5mL）。D.2试剂和培养基D.2.1水：GB/T6682，二级。D.2.20.45%氯化钠缓冲液。D.2.3二甲基甲酰胺：分析纯。D.2.4氢氧化钠：分析纯。D.2.575%酒精。D.2.6药敏纸片。-20℃保存，药物种类及其溶解试剂见表D.1。药敏纸片可从可靠的供应商采购或自行制备。D.2.7抗菌药物标准品。抗菌药物种类参见表D.1，标准品由兽药管理部门指定单位提供。D.2.8水解酪蛋白琼脂（Mueller-HintonAgar,MHA）：参见C.2。D.2.9水解酪蛋白肉汤（Mueller-HintonBroth,MHB）：参见C.3。D.3纸片扩散法D.3.1制备菌悬液从培养16h～24h的BHIA斜面上挑取纯培养菌，用0.45%氯化钠缓冲液配制成1.0×108CFU/mL～2.0×108CFU/mL的菌悬液。D.3.2接种平板制好的菌悬液应在15min内使用。用微量移液器取100μL到MHA平板上，灭菌玻璃涂布棒涂匀。DB11/T1397—20178D.3.3贴药敏纸片用灭菌的镊子取药敏纸片贴到D.3.2接种好的MHA平板上，镊子轻按药敏纸片，使药敏纸片与培养基紧密相贴。每个培养皿均匀贴四片，标记药物名称、菌株名称和培养时间等。于28℃±2℃(杀鲑气单胞菌为22℃±2℃)孵育15min。D.3.4测抑菌圈直径将D.3.3孵育后的平板倒置于28℃±2℃(杀鲑气单胞菌为22℃±2℃)生化培养箱中，培养24h±2h后，观察结果。用游标卡尺或直尺测量抑菌圈直径（mm）。D.3.5结果解释按照表D.1的标准对抑菌圈大小作出解释，判断病原菌对抗菌药物敏感或耐药。表D.1鱼类病原菌的抑菌圈直径解释标准和相对应的最低抑菌浓度值（MIC）药物种类药名配制母液的溶剂药敏片含量（μg/片）MIC（mg/L）抑菌圈直径（mm）敏感耐药耐药敏感磺胺类药物磺胺甲噁唑1mol/LNaOH300≤100≥350≤14≥17磺胺类药物磺胺嘧啶1mol/LNaOH300≤100≥350≤14≥17磺胺类药物磺胺二甲嘧啶1mol/LNaOH300≤100≥350≤14≥17磺胺类药物磺胺间甲氧嘧啶1mol/LNaOH300≤100≥350≤13≥17四环素类盐酸多西环素蒸馏水30≤4≥16≤13≥16氨基糖苷类硫酸新霉素蒸馏水10≤4≥16≤12≥16酰胺醇类氟苯尼考0.1mol/L二甲基甲酰胺30≤4≥16≤13≥18酰胺醇类甲砜霉素0.1mol/L二甲基甲酰胺30≤4≥16≤12≥16氟喹诺酮类恩诺沙星2.5mol/LNaOH5≤2≥8≤12≥16D.4浓度梯度稀释法D.4.1菌悬液制备按D.3.1制备的菌悬液，用灭菌的MHB稀释100倍备用。D.4.2抗菌药物的配制将不同种类的抗菌药物用相应溶剂溶解后（参见表D.1），用蒸馏水稀释、定容。磺胺类药物配成10240mg/L的原液，其它药物配成1280mg/L。用一次性针头过滤器过滤后，4℃冰箱保存，2d内使用。D.4.3抗菌药物药液浓度梯度的建立操作方法按GB/T27623.1—2011中的第5.2条款执行。D.4.4菌液接种在上述制备的药液浓度梯度的试管中，每管加0.1mL的新鲜配制好的待测菌悬液，混匀。D.4.5孵育DB11/T1397—20179接种菌悬液后，尽快置于28℃±2℃(杀鲑气单胞菌为22℃±2℃)下培养24h～48h，每24h观察并记录一次结果。D.5结果记录按GB/T27623.1—2011中的5.5条款执行。_________________________________