流感的相关知识及实验室检测

流感的相关知识及实验室检测陈宪楷2018.5.24流感的相关知识回顾1流感病毒的实验室检测2流感病毒亚型的鉴定3实验室检测的相关影响因素分析4C流感病毒流感的相关知识回顾1流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。人类的流行性感冒病毒(influenza,简称流感），属正粘液病毒科，分A（甲）、B（乙）、C（丙）三型，呈球形或丝状，是一种造成人类及动物患流行性感冒的负链RNA病毒。流感病毒的基因组RNA与NP构成RNP基因组由8个短的单链RNA构成，包含11个基因，编码11个蛋白：血凝素(HA),神经氨酸酶(NA),核蛋白(NP),M1,M2，NS1,NS2（NEP：核输出蛋白），PA,PB1（聚合酶基团1),PB1-F2和PB2。甲型流感致病性强哺乳类动物（猪，鲸鱼，马，海豹和猫）或禽类都会被广泛感染容易发生突发性变异，从而引起普遍性流感，世界性大流行丙型流感以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。乙型流感只会感染人类和海豹有限的宿主导致不会发生重大突变，呈局限性流行NP（核蛋白）和MP基质蛋白(M1)抗原性稳定，具有型特异性，将流感分A（甲）、B（乙）、c（丙）三型甲乙型流感主要亚型血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原结构极易发生变异，有亚型的特异性，是甲型流感病毒分亚型的主要依据,甲型流感命名通常会遵照HN的规则命名，H代表血凝素，可分为16个亚型；N代表神经氨酸酶，有9个亚型。会季节性在人群中出现的亚型通常为H1，2和3，以及N1和2根据乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分为B型(Yamagata)和B型(Victoria).根据国家流感中心报道，今年监测到的流感病毒以甲型H1N1亚型和乙型（Yamagata）系为主，并且总体上甲型H1N1亚型的比例超过B（Yamagata）系。甲型H3N2亚型和B（Victoria）系以低水平共同流行。我国流感流行现状及亚型不仅在中国，在欧洲一些国家和地区，今冬流行的流感病毒优势毒株是B型（Yamagata），这一毒株沉寂已久，普通人群对它的免疫基本缺失图.中国流感病毒检出率及其亚型分布流感的季节性流行冬春季夏季冬春季长江以南长江以北流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异。高峰期1.流感患者2.隐性感染者1.近距离飞沫传播2.接触传播流感的流行病学传染源传播途径病毒变异快65岁以上老年人、婴幼儿、慢性病患者反复感染并发症感染流感的一般临床表现：流感一般急性起病，主要表现为发热(可达39-40℃)，伴畏寒、寒战、头痛、肌肉关节酸痛、极度乏力、食欲减退等全身症状，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流涕，也可有呕吐、腹泻等症状。一般来讲，流感全身症状比普通感冒重。流感为自限性疾病，发病3-4天后体温逐渐消退，全身症状好转。重症病例可导致慢性基础病加重，也可出现病毒性肺炎、心脏和神经系统损伤等并发症。流感病毒的实验室检测2流感病毒的实验室检测采集标本类型：常规特殊咽拭子鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液、含漱液血清呼吸道灌洗液实验前处理流感标本采集采集时间：病人发病的头3天内采集，最好是24h内咽拭子采集咽拭子用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。注意：采样前1h内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗生素标本的处理和保存标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液有：PH7.4-7.6的Hank’s液或MEM标本应在4℃保存24小时内送至实验室，实验室对收到的标本最好24～48小时内进行检测或接种。如不能在48h内检测或接种，标本应置于-70℃保存实验室生物安全要求01季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级实验室进行。03用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全Ⅰ级实验室进行流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。0203常见的流感病毒实验室检测方法检测方法灵敏度特异性优点缺点分子诊断（RT-PCR）高高病毒含量低的标本检出率高，耗时短培养法（细胞培养法、鸡胚培养法）低高在分子生物学问世前，一直是流感实验室诊断的金标准，至今仍不可取代阳性检出率低，漏检率高，耗时长，技术要求高快速试纸条法（金标法）较低较高操作简单，耗时短，不需仪器设备，适用于快速筛查存在假阴性，漏检率高，只能鉴定出流感病毒A、B型，不能进行亚型鉴定血清学检测（血凝抑制试验）高高能够鉴定亚型要求急性期和恢复期双份血清，对于季节性流感仅限于流行病学调查及回顾性诊断季节性流感检测流程临床标本采集接种MDCK细胞接种鸡胚红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集试验流感病毒核酸检测阳性PCR鉴定流感病毒亚型的鉴定3红细胞凝集试验1红细胞凝集抑制试验2流感病毒亚型的鉴定流感病毒亚型的鉴定流程红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”红细胞凝集抑制试验判定流感病毒型别红细胞凝集试验（HA）MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现红细胞鸡火鸡豚鼠人O型血红细胞马适用范围流感和禽流感病毒流感和禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒终浓度（％）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形状U或V型U或V型U型U型U型孵育时间30min30min45min45min60min细胞对照细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状细胞沉积成环状AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液50ulPBS稀释病毒加入配制好的红细胞悬液充分混匀，置室温孵育30-60分钟观察记录结果操作简图病毒原液1:21:128HA:32HA＞128HA:4红细胞凝集试验（HA）结果判读HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；若传1～2代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定红细胞凝集抑制（HI）试验HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。红细胞凝集抑制试验步骤每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟加入25ul4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟稀释血清4个凝集单位的配制和检测观察记录结果红细胞凝集抑制试验稀释血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul急性期恢复期病毒液操作简图流感病毒的型别判定标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价≥20才可以算为阳性待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此型别的流感病毒一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制实验室检测的相关影响因素分析4约60%-70%不准确的检验结果产生于分析前阶段做好分析前的质量控制是保证检测结果准确可靠的先决条件影响流感病毒检测的因素也大多出现在分析前影响流感检出率的因素采样部位的选择标本采集时间的选择检测方法的选择其他因素采样部位的选择就不同采样部位而言，国内外关于采样部位的研究主要集中在鼻拭子、咽拭子和下呼吸道吸取物，一般认为鼻拭子因含有较多呼吸道上皮细胞导致流感病毒检出率高于咽拭子参考文献李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335ISTIC标本采集后获取的呼吸道上皮细胞含量决定着采样质量；而有研究提示，不同型别的流感病毒对于定居部位有着一定的嗜性，虽然都是入侵呼吸道上皮细胞，但是选择的部位可能有所不同，导致不同型别的流感病毒在不同的采样部位检出率不同从标本采集时间上分析，有文献报道，发病后2d就诊的流感样病例，流感病毒阳性检出率明显高于其他各组，发热4天后就诊患者流感病毒阳性检出率最低，随着病程的延长，咽拭子病毒核酸的检出率呈下降趋势因此对于高危人群，应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位、多次取样检测,以提高流感病毒阳性检出率标本采集时间的选择参考文献李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335ISTIC检测方法的选择有研究对流感病毒胶体金抗原快速检测法与核酸PCR法比较，两者之间一致性较差。以咽拭子流感病毒核酸检测为标准，流感病毒抗原快速检测法（胶体金法）的敏感性和特异性分别为27.6%和86.9%，其敏感性明显低于国内外文献报道的水平（40%-85%）；参考文献李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335ISTIC流感病毒胶体金抗原快速检测阳性检出率17.6%；核酸检测阳性检出率为31.0%；标本例数阳性例数阳性率合计2017年金标法FLUA12738139310.9%16.4%5.5%FLUB697核酸检测FLUA1163413.5%4.9%FLUB161.4%2018年1-4月金标法FLUA7607901.2%22.5%FLUB162021.3%核酸检测FLUA20052.5%8.5%FLUB126%我科2017年和2018年1-4月流感阳性率统计文献报道17.6%31%导致我科流感核酸检测检出率与文献报道不符的原因分析？文献报道筛选的病人是高度怀疑流感病人，用于进行方法学比对试验，与我们的统计人群无可比性我院进行流感核酸检测的病人大多是儿科具有呼吸系统疾病的儿童，医生主要用于排除诊断核酸检测的检测样本例数远远小于金标法2体温年龄标本储存温度其他因素31-有研究发现：年龄60岁、体温在38.0℃~38.9℃之间，流感病毒阳性检出率高于其他组；参考文献李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335ISTIC张杰，武晶晶等.不同温度和不同放置时间对总RNA提取浓度和纯度的影响[J]实验技术与管理.2013,11-有文献报道：不同的放置时间和温度会影响RNA提取的质量浓度，但对RNA纯度和完整性无明显影响。建议关于如何提高我院流感检出率B未检测送检标本应在4℃保存，防止RNA降解C金标法阴性的可疑流感病人，建议医生进一步选择灵敏度更高的核酸检测，以防漏检D对于高危人群，应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位、多次取样检测,以提高流感病毒阳性检出率A组织培训，规范取材，保证送检标本质量THANKS