LI-6400光合作用测定系统-原理、性能、基本操作与常见故障的排除

-1-植物学通报刊996，13（增刊）：72-76ChineseBulletinofBotanyLI-6400光合作用测定系统：原理、性能、基本操作与常见故障的排除蒋高明（中国科学院植物研究所，北京100093）LI-6400PORTABLEPHOTOSYNTHESESSYSTEM：PRINCIPLE，FUNCTION，BASICOPERATIONANDMAINPROBLEMSANDSOLUTIONSDURINGMEASUREMENTJiangGao-ming(InstitutefoBolany,AcademiaSinica,Beijing100093)LI-6400光合作用系统（LI-COR,1995）是美国拉哥公司在已有的LI-6200（LI-COR,1990）光合作用系统基础上改进而来。LI-6200为封闭型光合作用测定装置，在测定过程中叶室内的CO2浓度不断减少或升高，仪器根据一定时间内CO2浓度的变化以及气体流速、温度、大气压等环境参数计算光合作用或呼吸作用速率.这种设计的主要缺陷是；在光合作用测定过程中，叶室封闭，CO2、水分、温度等变化很大，影响植物正常的气体交换。鉴于此，拉哥公司新近推出了LI-6400开放型光合作用系统，于1995年2月份上市.作者在美国哥伦比亚大学生物圈二号研究中心工作期间，利用这种仪器在该中心内进行了半年的光合作用测试，取得了一定经验.鉴于我国植物生理生态工作者可能在不久将接触此仪器，加上该仪器的英文说明书为专业人员所写，涉及仪器工作原理内容较多，某些操作步骤介绍过繁，而另一些步骤则过简或不提及，可能使初用者感到困惑；另外，我们在美国使用该仪器过程中发现的问题，可直接与拉哥公司联系解决，这在国内难以做到.因此；特将该仪器主要原理、性能、基本操作步骤、常见故障分析等问题，总结出来，以期对我国有关科研人员使用此仪器时有所帮助。原理在LI-6200的基础上，LI-6400光合作用系统在两个方面作了明显的改进：第一，气路为开放式，即从进气口进入仪器主机的气体经主机内部流速测定计后一分为二，25％进入参考气体红外分析仪；75％进入样品气体红外分析仪，然后气体各自排出仪器，气路开放.除这种方式外，仪器在自动平衡（Automatch，是测定过程中重要的步骤，下面还要介绍），从样品气体红外分析仪排出的气体进入参考气体红外分析仪再排出机外。第二，CO2与H2O的红外分析部位在探头上，与叶室紧紧相联，这样缩短了气体流动过程中气路过长产生的误差。在光合作用测定过程中，有两种光源可供选择：一是自然光，用透明叶室；二是自动光源（为红光），此时将叶室的透明部分换成含产生光的部分（用自动光源时需事先设定程序）.用自动光源测定时可测定植物的最大光合作用（Amax，即达到光饱和点时的光合作用）以及光合作用／光照强度曲线。测定时，仪器根据参考气体与叶室气体CO2浓度差、气体流速、叶面积等参数计算光合作用或呼吸作用速率；根据参考气体与叶室气体H2O浓度差、气体流通、叶面积等参数计算蒸腾速率；根据参考气体H2O与叶室H2O浓度与蒸腾速率计算叶面水分总导度；又据此以叶片两面的气孔密度比-2-率计算水分气孔导度即气孔导度（其倒数即为气孔阻力）；根据气孔水分导度、叶片两面气孔密度比率、叶面边界层阻力计算气孔对CO2的导度；最后，据气孔CO2导度、蒸腾速率、参考气体CO2浓度、光合速率计算间CO2浓度（Ci）。有运算均由内部计算机系统完成，可在仪器的荧光屏上直接读数.故LI-6400能够测定的植物光合与水分生理指标有：净光合（呼吸）速率、蒸腾速率、总气孔导度、气孔导度或气孔阻力、胞间CO2浓度等.另外，叶室内装有温度与湿度探头；外有光照强度探头.在测定过程中能够自动记录的重要环境参数有：大气CO2浓度、大气湿度、叶面温度、大气温度、光照强度等.上述植物生理指标与环境参数测定可在数秒内完成。仪器自动存储在电脑部位.除此之外，其他参数如叶面水汽压降、叶面相对湿度、叶面积、叶室CO2浓度、叶至H2O浓度等，以及仪器工作状态参数如电池寿命、记录时间、气体脉冲信号等连同上述实测与计算的数据与参数共有70项，一并记录于电脑中，供研究者分析数据时参考。性能从上述的介绍可以看出，LI-6400功能非常完备，且测定迅速.但是，所获数据尤其是计算数据的可靠性完全有赖于操作者对仪器性能的了解、测定前仪器的标定、仪器工作状态，更重要的是使用者的经验及其植物生理生态学基础.在数秒内测定的70种数据与参数在什么时候贮存，要求操作者有非常好的经验.否则，仪器记录的数据可能是错误的。但是，只要仪器标定好并进入工作状态后，仪器测定的数据是非常精确的.另外，该仪器在光合作用生理研究方面具有两种独特的程序是LI-6200或一般光合作用测定系统所不具备的.即光合作用／光照强度曲线和光合作用／胞间CO2曲线.前一条曲线的测定要求自动光源、充气塑料袋（约20L）和气泵，在恒定的CO2浓度、气温和相对湿度下测定.后一条曲线的测定要求辅助的CO2混合器（CO2Mixer），由拉哥公司研制，于1996年2月上市，能够产生一系列的CO2浓度.从光合作用／光照强度曲线上可以得知植物的光补偿点和光饱和点以及光能利用效率等；从光合作用／胞间CO2浓度曲线上可以得知植物的CO2补偿点和饱和点、羧化效率与RuBP（l，5-二磷酸核酮糖）核化酶活性等.这两条曲线的研究是当今全球变化生态学研究中的植物生理生态学的重要内容.可直接在屏幕上显示曲线并存储数据。而用其他光合作用仪器测定时则费时费力，另外数据的变异性大。LI-6400主要性能指标有：工作温度0-50C，相对湿度10-90%（92%时仪器拒绝工作或停机）；CO2红外分析仪测定范围0-3000µmolmol-1,分辨率0.1µmolmol-1，在0-1500µmolmol-1之间误差为±5µmolmol-1,1500-3000之间为±10µmolmol-1；H2O红外分析仪测定范围为0-7kPa或露点温度（Dewpoint）40C，分辨率0.001kPa，误差＜0.006kPa；光感应器测定范围为0-3000µmol–2S-1,分辨率＜lµmolm-2pm。lm”s-1，误差±.7%。该仪器的特点也是缺陷之一是能够测定的叶面积很小，标准仅为6cm2，因而当测定的数据放大（即用每平方米每秒表示光合速率或呼吸速率）时，对叶面积的要求很严.优点是对叶面积＜6cm2的叶如针叶、鳞叶或小型条状叶等也可测定，只要采集叶标本，用叶面积仪测定出叶面积后即可再次对数据计算（仪器记录当时的一切参数，输入新的叶面积后可得确切的数据；同理，因海拔高度改变引起的大气压等参数变化也可改变后重新计算）。基本操作要点（一）仪器标定LI-6400在使用前必须标定，约需1小时完成.如一天内连续测定，早晨标定一次即可。标定需用标准CO2气体（浓度高于被测环境CO2浓度）和湿度发生器.湿度发生器可与LI-6400同时购置，-3-拉哥公司具LI-610露点湿度发生器（LI-COR，1993）.该仪器为仪器标定过程所必需，缺乏则无法完成仪器标定，故购置LI-6400时宜同时购买LI-610露点湿度发生器.标定要点如下：l.开机预热20分钟。同时打开LI-610露点湿度发生器预热。2.进入Open（开机）状态，按f3键，进入Calibration（标定）状态。3.将CO2去除剂（碱石灰）和水分干燥剂（均在主机左侧）上方的开关彻底打开（逆时针方向），这样气流经CO2去除剂和水分干燥剂后，变成无CO2和H2O的空气进入红外分析部位。4.选择FlowRateZero（流速调零），调气体流速为0，以电信号±1mVmin-1为准.用荧屏左右的上下红色箭头键调节（下同）。5.选择IRGAZero（红外气体分析仪调零）.首先调CO。为零，再调H2O为零，用f1，f2，f3功能键调之.要求CO2达到±0.15µmolmol-1，H2O±0.01mmolmol-1。6.完成上述步骤后，将CO2去除剂和H2O干燥剂开关彻底关闭（顺时针方向，说明书上未提及此步骤）.然后将探头上进入样品分析室的塑料管（带黑色环者）打开，并与标准CO2钢瓶塑料管连接。7.选择IRGASpan(红外气体分析仪调跨度)，然后分别调CO2-A和CO2-B（参考气体和样品气体CO2红外分析仪，下同），用上下箭头调节，直至与标准气体CO2浓度相差±1µmolmol-1以内。8.将上述打开处与LI-610露点湿度发生器连接.在LI-610随带的室温、相对湿度与露点温度关系图上查出在标定工作环境温度下希望得到的相对湿度（应以测定地点的环境湿度为准），并在职LI-610上设置该温度.在IRGASpan状态下，选择H2O-A和H2O-B（参考气体和样品红外H2O红外分析仪，下同），并以LI-610标定之，以露点温度相差外0.01C为准。9.完成上述标定后，选择STOREflowRate（流速调零存盘）和SoreZero&SpanInformation(红外分析仪调零、调跨度存盘)存储标定参数，这样仪器即可在标定的状态下工作。（二）测定10.在Open状态下，按f4键，进入NewMeasurement(测定)状态。11.打开叶室，夹住被测植物叶片，使叶在叶室内的方向与其着生方向一致（用自动光源时不必作此要求）.若被测叶片面积＜6cm2，则应准备塑料袋采集新鲜标本，待野外测定完成后回室内测定叶面积，或来不及测定时可暂存冰箱内待测。12.待荧屏上CO2-A、CO2-B、H2O-A、H2O-B、光合作用、蒸腾作用等显示的数据基本稳定后（约需3分钟），按数字6，进入Autolog(自动存储)状态.测定过程中，LI-6400有三种数据存储命令，另两种为Log（存储）和StdFileDialog（以文件形式的数据存储），三种方式比较起来以Autolog易操作。13.在Autolog状态，给定文件名，输入测定次数（3-4次即可）、时间间隔（8-10秒即可）、仪器自动平衡（Automatch）的次数(2次即可)，Automatch非常重要，LI-6400在此命令下能够自动调整CO2-A、CO2-B或H2O-A、H。0-B，使它们对同一气体浓度读数一致。因为LI-6400根据两套红外分析仪的CO2和H2O浓度差计算光合作用和蒸腾作用，若它们对同一气体的浓度读数不一致，难以保证数据质量。14.按数字1，观察仪器测定和存储数据的次数，待完成给定的次数后，按f3关闭文件，进行下次测定.15.如在同一天内进行多次测定，可连续使用同一文件名，只是在Remark（标志）时，以不同的植物名称或地点或样品号区别之。（三）数据转存计算机和文件删除LI-16400内存空间较小，约存20个左右的文件（相当于连续20天的观测数据文件）后，空间即满，必须将数据转存计算机井删除文件腾出空间后仪器才能继续工作.LI-6400自备与PC微-4-机兼容的软件，将其装入计算机后可通过电缆将数据转入计算机。16.在Open状态下，按f3进入Utility（应用）状态。17.在要转移的文件前标志（按回车键即可，再次按动则标志消失）.联机后用Prnit命令将数据转移。18.文件删除时，首先标志待删文件，按Disk（或k），然后再按Space(或s)，最后按任意键可删除标志文件。以上是LI-6400操作中的一些关键步骤，具体操作很复杂.应仔细弄懂仪器原理后，依照说明书（LI-COR，1995）步骤操作。常见故障及其排除下述现象在仪器使用过程中可能会发生，有些并非仪器出毛病，只是仪器未进入工作状态而已.但即使非常小的问题仪器也会拒绝工作或数据不准，所以操作过程中发现问题后应及时纠正。l.开机后荧光屏不显示.需要更换电池.仪器使用过程中，至少需要4个LI-6400特制电池（每次两节，与LI-6200通用）.一般＜11。5V时仪器提出警告，留1-2分钟更换电池，如来不及更换时仪器自动关机，这样易丢失数据.故最好提前更换，两节新充好电的电池最多连续使用4小时。2.仪器标定时CO2和H2O无法调零，即C