Menke体外产气法

1Menke体外产气法（Syringe系统）——管子（一）基础知识体外产气法主要理念通过体外产气装置模拟瘤胃发酵体外产气系统组成体外产气装置：产气管（相当于独立的瘤胃）、恒温水浴摇床（模拟瘤胃温度和蠕动速度）；微生物培养液：由瘤胃液与人工唾液按1:2的体积比混合，搅拌均匀而成影响实验成败的主要因素实验过程中产气装置的温度，整个操作过程的厌氧状态、微生物活力是影响实验成败的关键（二）试验前准备试配产气管①更换注入口处老化的塑胶管；②试配外管和内塞，要求推拉自如又不过松（现已将可匹配的外管和内塞统一编号，依号装配即可）。称量样品①产气管编号；②用自制的带长柄的称量纸，准确称取待测样品约200mg（DM），置于体外产气管底部，注意不要让样品进入产气管注入口和沾染30ml以上管壁；③样品称取完毕后，管塞上均匀涂抹凡士林，将管塞塞回对映的外管，扣好夹子。配制原液正式实验前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、缓冲液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可过量配制，常温下存放，配制方法见附表1）。其它①调试恒温水浴摇床的温度至39±0.5℃，摇动速度5×10转/min，如果使用两个恒温水浴摇床要求两者温度和摇动速度尽量一致，另外还需要将一多联水浴锅温度调至39±0.5℃（以实际量取温度为准）；②准备二层、四层、六层纱布各2-4块（纱布可重复使用）；③贮备两瓶热水，准备收集瓶（收集和过滤瘤胃液用）、水桶、温度计，以备次日取瘤胃液用。（三）正式试验配制人工唾液①将恒温水浴摇床、多联水浴锅打开后；②计算人工唾液需要量：体外培养时每根产气管内微生物培养液的体积是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依据试验设计的产气管数计算人工唾液和瘤胃液的需要量（预留20%，以备操作手法不当造成浪费）；③配制还原剂（E液，见附表1）；④按附表2的顺序和比例将配制好的各原液混合后，置入水浴摇床或水浴锅内，通入CO2气体（气流不易过大），使人工唾液由蓝色转变为粉红色，最终为无色。采集与处理瘤胃液为方便读取12h产气量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液为早饲前2h瘤胃液。①到牧场后，将热水倒入水桶，调节水温度至39±0.5℃，用于瘤胃液保温（应经常用热水调节）；②用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意盖上瓶盖，以防氧气对微生物的影响）；③回到实验室后，将收集瓶置于水浴锅内，四层纱布过滤（应尽量快，以保持微生物的活力），获得的滤液用CO2气体饱和；④用量筒量取所需量的无色人工唾液和瘤胃液混合，不间断地通入CO2气体。吸取微生物培养液用空的产气管吸取微生物培养液30ml，通过三通管推入已经装有样品的产气管。记录初始微生物培养液量排气过程：将注入口处夹子打开的同时，用手下拉管塞，以防样品冲入塑胶管；摇晃产气管使样品与瘤胃液混合后，旋转管塞，排出管内空气；读数：将产气管竖直，注入口向下，读取刻度。排气后的产气管应随机置于恒温水浴摇床内培养（摇床在操作过程中处于摇动状态，以免温度上升）。空白对照和标准对照实验过程中要有至少3个空白对照和3个标准干草对照（样多时，对照一定要多，尤其是空2白对照）。空白对照不加样品直接加入30ml微生物培养液，标准干草对照以200mg（DM）干草（优质的过80目筛的羊草）为底物，加入30ml微生物培养液。为了消除操作顺序和恒温水浴摇床条件的差异，要求空白对照和标准对照平均分布于试验前期、中期和后期，放置于水浴摇床的不同位置。记录产气量培养2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h时（试验样品为粗料，一般培养到72h或96h；精料一般培养到24h或48h即可终止培养，若要计算产气常数，一般要72h），记录产气管的刻度读数（读数时轻摇产气管，旋动管塞后读数，读数时，以管塞刻度的中部为准）。如果产气量过多，下一时间点产气量可能超出刻度范围，则需放气，其操作与排气相同。产气量计算空白ttGPVVWGP0200（管子）式中，GPt为样品在t时刻的产气量（ml）；Vt为样品发酵t小时后，产气管刻度读数（ml）；V0为样品在开始培养时产气管刻度读数（ml）；W为样品干物质重（mg）；GP空白为空白对照在t时刻的产气量，其计算方式与GPt一致。重复试验要求体外产气试验至少培养两次，两次标准干草产气量相对偏差小于10%（若标准干草产气量与实验室积累的平均值29.5相差太大，应考虑重作，检查动物状况）。(四)样品采集测定项目取样时间取样部位取样量重复数处理保存温度VFA实际需要上清液1ml-加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g离心10min4℃NH3-N24或48h混合液5ml--20℃MCP24或48h混合液24ml--20℃附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O13.2g;MnCl2.4H2O10.0g;CoCl2.6H2O1.0g;FeCl3.6H2O8.0g;加蒸馏水至100mlB、缓冲液：NH4HCO34.0g;NaHCO335.0g;加蒸馏水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O9.45gKH2PO46.2gMgSO4.7H2O0.6g加蒸馏水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸馏水E、还原剂溶液（现用现配）：1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg加蒸馏水95ml附表2：人工唾液配制表（1000ml）顺序原液体积（ml）1蒸馏水520.22微量元素溶液（A液）0.1整个过程要尽量快，特别是吸培养液和排气，最好不要超过15min33缓冲液（B液）208.14常量元素溶液（C液）208.150.1%刃天青溶液（D液）1.06还原剂溶液（E液）62.4嘌呤法测定体外微生物蛋白产量（一）操作流程图标准曲线制备样品处理5、15、25、35、45、55mg酵母90-95℃水浴1h加入2ml0.6MHClO48ml发酵液4℃20000g20min沉淀2.104ml0.6MHClO4加入冷却加入6ml28.5mMNH4H2PO490-95℃水浴15min冷却4℃3000g10min上清液1.6ml加入6ml0.2MNH4H2PO4用85%磷酸调整溶液pH为2–3溶液3.8ml加入0.2ml0.4MAgNO35℃避光、过夜4℃3000g10min沉淀4.5mlpH=2的蒸馏水冲洗4℃3000g10min沉淀加入5ml0.5MHCl90-95℃水浴30min4℃3000g10min上清液0.5MHCl稀释40倍0.5MHCl作参比260nm下比色4（二）试剂配制及具体操作1、试验试剂A0.2M磷酸二氢铵23g磷酸二氢铵溶解于700ml蒸馏水，定容至1000mlBpH=2的蒸馏水在蒸馏水中加少许硫酸至pH=2C0.4M硝酸银准确称取1.6987g硝酸银，溶解于15ml蒸馏水中，待完全溶解后定容至25ml。溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑纸D0.5M盐酸用蒸馏水稀释10ml盐酸（37%）至240mlE28.5mM磷酸二氢铵用蒸馏水稀释100ml0.2M磷酸二氢铵至700mlF85%磷酸G0.6M高氯酸用蒸馏水稀释10ml高氯酸（70%，12M）至200ml2、测定步骤A．酵母RNA标准曲线的制作:①分别称取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml离心管中，并加入2ml0.6MHClO4，于90-95℃水浴1小时，冷却；②再分别加入6ml28.5mMNH4H2PO4，于90-95℃水浴15min，冷却后在3000g，4℃条件下离心10min；③取1.6ml上清液，向上清夜中加入6ml0.2MNH4H2PO4溶液，并用85%磷酸调整溶液pH为2–3（一般需85%磷酸25µl）；④取调整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml0.4MAgNO3，混合，于5℃条件下避光、过夜；⑤过夜后于3000g，4℃条件下离心10min，弃上清液；用4.5mlpH=2的蒸馏水冲洗沉淀；再于3000g，4℃条件下离心10min，弃上清液；⑥向沉淀中加入5ml0.5MHCl溶液，混匀，在90-95℃条件下水浴30min后，以3000g离心10min；⑦上清液用0.5MHCl稀释40倍后，以0.5MHCl溶液作参比，在260nm下比色，根据光密度值作出标准曲线。B．培养液中微生物蛋白质的测定:①取8ml均匀发酵液于3个10ml离心管，在20000g，4℃条件下离心20min；弃上清液后加入2.104ml0.6MHClO4，于90–95℃水浴1小时，冷却；②按照制作标准曲线的步骤②-⑥操作；③以0.5MHCl溶液作参比，在260nm下比色，根据光密度值和标准曲线求出RNA测定值；④根据下面公式计算微生物蛋白氮产量：其中，RNA含氮量为17.83%，细菌氮中RNA含氮量为10%。浙江大学奶业科学研究所微生物蛋白氮（mg/ml）=RNA测定值（mg/ml）×RNA含氮量×稀释倍数细菌氮中RNA含氮量5比色法测定培养液氨态氮浓度（一）操作流程图标准曲线制备样品处理0.4ml标准系列溶液加入①5ml发酵液3500-4000rpm10min2ml上清液8ml0.2MHCl加入取0.4ml混合液②加入2mlE液摇匀、静置10min0号管液作参比700nm下比色摇匀2mlD液保存液工作液6（二）试剂配制及具体操作1试验试剂A0.2M盐酸溶液将18ml浓盐酸用蒸馏水稀释到1000mlB14%水杨酸钠溶液称取14g水杨酸钠，用蒸馏水溶解，定容至100mlC0.3M氢氧化钠溶液1.2g氢氧化钠用蒸馏水溶解并定容至100mlDD液称取0.08g亚硝基铁氰化钠溶解于100ml14%水杨酸钠溶液中EE液量取2ml次氯酸钠溶液（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml0.3M氢氧化钠溶液中摇匀2测定步骤A、氨氮标准系列溶液制备①准确称量0.382g氯化铵，用0.2M盐酸溶解，并定容到100ml，作为保存液，在冰箱中可存放数月。②取保存液10ml，用蒸馏水稀释定容至100ml，为工作液。含氮量为10mg/100ml。③取工作液0、1、2、4、6ml置于5个编号的50ml容量瓶内，接着分别加入蒸馏水10、9、8、6、/4ml，使之都成为10ml，再用0.2M盐酸定容。这就是每100ml中含氮量为0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的标准系列溶液。B、比色与计算①准确量取标准系列溶液0.4ml分置于5个10ml试管内，各管中再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。②用消光值作自变量，溶液含氮量作从变量导出回归方程式。③样品处理：取5ml瘤胃培养液在3500-4000转/分下，离心10分钟，量取2ml上清液（若含氮量较高，可取1ml上清液再加1ml蒸馏水），置于15ml试管内，再加入8ml0.2M盐酸至10ml摇匀（稀释倍数为5或10）。比色操作同：准确量取各溶液0.4ml置于10ml试管内，各管内再依次加入D液和E液2ml，摇匀，静置10分钟后比色。波长700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0号管液作空白对照。记录各消光值。把测得的消光值代入回归公式，计算的结果乘以样品稀释的倍数就是原样中氨氮的含量。浙江大学奶业科学研究所7柱温体外发酵产物中挥发性脂肪酸浓度的测定（一）操作流程图（二）试剂配制及具体操作1混标制备按表1或表2中梯度，配制6个梯度的混合标样，用于制作标准曲线。表1乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制（umol/ml）123456乙酸10204080160320丙酸12481632丁酸12481632表2乙酸、丙酸和丁酸混合标样的配制（ul/ml）123456乙酸0.5711.1432.2854.5709.14018.280丙酸0.0750.1490.2990.5981.1962.390丁酸0.0920.1840.3670.7351.4702.9392上机测定HP-INNOWAX（19091N-13