大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化一可溶性蛋白的纯化（一）菌体的破碎1.仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mMPBS或50mMTris-HClpH7.5；50ml离心管；冷冻高速离心机2.方法2.1反复冻融2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4℃离心15min，弃上清。2.1.2菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mMPBS或50mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。2.1.3然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml,EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。2.1.4将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2.2超声波处理(对超声波及热敏感的蛋白慎用)2.2.1将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。2.2.2取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。注意事项：（1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。（2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。（3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。（4）可通过SDS-PAGE电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。二包涵体蛋白的纯化1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了）1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mMPBS或20mMTris-HClpH7.5；裂解液bufferA；溶菌酶10mg/ml；50ml，15ml离心管；冷冻离心机1.2方法(1)收集菌液500ml，等分10份，4000r/min4℃离心15min，弃上清。（2）菌体沉淀中加入相同菌液体积的20mMPBS或20mMTris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH，一般为7.5-8.0），重悬洗涤2-3次，弃掉上清。（3）然后沉淀按原菌液体积每500ml以15ml预冷的裂解液bufferA重悬。(有的文献为每克湿菌加4ml-10ml裂解液)（4）每毫升悬液中加入100ul10mg/ml溶菌酶（即溶菌酶终浓度1mg/ml）。在冰上孵育15min（5）对15ml悬液进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数。超声破碎时保持冰浴。具体条件可根据实验情况而定。（6）4℃，4000rpm/min离心20分钟所得沉淀即为包涵体。注意事项：融合蛋白的分子量如果大于150KD时，用超声波破碎很容易将目标蛋白打碎而造成降解，故可用溶菌酶先做处理.2包涵体的洗涤(1)将包涵体沉淀重悬于含有适量脲（1-4M）的BufferA中，每克湿重加4-6ml洗涤液。(2)超声波处理5秒打碎沉淀，继续用注射器吸入并挤出悬液，重复数次，4℃涡旋悬液30min。或者高速搅拌悬液10min。(3)4℃，4000rpm/min离心15分钟。(4)重复上述操作2次至上清液透明无色。(5)将包涵体沉淀重悬于BufferA，4℃，4000rpm/min离心15分钟，弃掉上清。注意事项：(1)包涵体洗涤时增加NaCl浓度到0.5M，有助于包涵体中杂蛋白的溶解。(2)经提取洗涤后得到的包涵体，由还原SDS-PAGE电泳结合光密度扫描可知包涵体中目标蛋白的含量。(3)包涵体洗涤是纯化极重要的一步，不同培养条件下收集的菌液经洗涤可得到不同的纯度。50mMTris-HClpH8,0.2mMEDTA,100mMNaCl,1%Tritonx-100（或2%脱氧胆酸钠）1mMDTT1mMPMSF10mg/ml大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化(4)用通常的洗涤方法，如果包涵体达不到所需的纯度，可试用分级沉淀法初纯包涵体，步骤如下：(1)菌体破碎后将所得的包涵体悬浮于含6mol/L盐酸胍的BufferA中，4℃涡旋悬液30min，4000r/min离心20min，上清进行分级沉淀。(2)取一小部分上清用BufferA稀释到盐酸胍浓度为4M，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，上清继续稀释到3M，重复上面操作一直到2M，把每次沉淀和上清跑SDS-PAGE电泳分析，看目标蛋白在哪个盐酸胍浓度下纯度最高。(3)摸索好条件后，直接将剩余上清直接用BufferA稀释到所需的盐酸胍浓度，然后4℃涡旋悬液15min，静置30min，4000r/min离心20min，沉淀既为分级沉淀后的包涵体。超声破碎在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。离心1.0～1.5ml诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。常规操作步骤如下（以100ml培养液为例）：（1）100ml诱导后的菌液（OD600=1.2左右），12000rpm，4℃离心2min，收集菌体。（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS或者Tris-NaCl，针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。（4）破碎：将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。（5）分离上清和沉淀：12000rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。（6）SDS-PAGE分析蛋白表达情况。（7）准备纯化蛋白。超声破碎注意事项与一些小的改进：（1）破碎完全的判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。（4）尽量防止泡沫的产生。（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃），增加细胞的通透性。