培养基

第四章：培养基培养基：广义上讲培养基是指一切可供生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为生物培养提供除营养外的其它所必须的条件。培养基的作用：满足生物体的生长促进产物的形成提供生物生长的环境培养基的要求：①培养基能够满足产物最经济的合成。②发酵后所形成的副产物尽可能的少。③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。培养基的成分培养基(Culturemedium)：选用各种营养物质，经配制成适合不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。培养基的组成和配比合适与否，对微生物的生长发育、产品的产量、提炼工艺的选择和成品质量都会产生相当大的影响。培养基的营养成分及其功能1.碳源(Carbonsource)【糖类、脂肪、有机酸】：能源物质，构成菌体和代谢产物2.氮源(Nitrogensource)【无机氮源：氨水、硫酸铵、尿素、硝酸钠；有机氮源：豆饼粉、麦麸、玉米浆、蛋白胨；发酵菌丝体、酒糟】：构成菌体和代谢产物，硝化细菌的能源物质3.无机盐类(Mineralnutrition)【P、Mg、S、Fe、K、Na、Pb、Cl、Zn、Co、Mn等】：维持酶活力，调节渗透压、pH值、电位等4.特殊生长因子【生物素、硫胺素、肌醇等】：构成辅酶的组成部分，促进生命活动5.水：溶解营养物质和代谢产物培养基的配置原则根据不同微生物的需要配置不同的培养基何菌种？何产物？是固态还是液态？是种子还是发酵培养基？1.各种营养物质的浓度与配比，特别是C/N2.将培养基的pH控制在一定范围内3.考虑利用价廉且易于获得的原料废代好、粗代精、野代家、烃代粮、纤代糖、国代进、简代繁一、能源物质光能自养微生物：光能如：螺旋藻生产单细胞蛋白化能自养微生物：氢、硫、氨、亚硝酸盐、亚铁盐等无机物如：细菌炼铜异养微生物：碳水化合物、石油、天然气及石化产品二、碳源物质碳源物质是培养基主要成分；占细胞干物质的50％左右，提供能源、碳架、代谢产物。碳源物质的易利用顺序：葡萄糖（单）→蔗糖、麦芽糖、乳糖（双）→糊精→淀粉其他碳源物质：脂类、有机酸、石油等也能作碳源。糖蜜：蔗糖等的结晶母液，含糖50-70％，成分丰富，物美价廉。淀粉水解糖的制备糖化(Saccharify)：在工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程，得到的水解糖液叫淀粉糖。糖化的原料：薯类淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等。水解糖液的质量直接关系到生产菌的生长速度与代谢产物的积累，其中的低聚糖类与复合糖类等杂质越低越好。淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备酸解法反应原理：淀粉——————葡萄糖优点：设备单一、时间短（几分钟）缺点：对设备要求高（高温、高压、高腐蚀）副反应多，淀粉转化率低对原料要求高，淀粉颗粒大小均匀淀粉乳浓度不能太高酸（催化剂）高温高压StarchGlucose酶解法（双酶水解法）反应原理：淀粉———糊精、低聚糖———葡萄糖优点：对设备要求低，副反应少，产品纯度高，营养丰富对原料要求较低，淀粉乳浓度高缺点：所需设备较多反应时间较长（2-3天）淀粉酶糖化酶液化糖化淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备酶酸结合法之一，酸酶法反应原理：淀粉———糊精、低聚糖———葡萄糖优点：产品质量高，反应时间较短（2d）对原料要求较低，淀粉乳浓度较高用酸量少酸水解糖化酶淀粉水解糖的制备酶酸结合法之二，酶酸法反应原理：淀粉———糊精、低聚糖———葡萄糖优点：反应时间短（2hrs），产品质量较好对原料要求较低，淀粉乳浓度较高对淀粉颗粒大小无严格要求淀粉酶酸水解30min30min淀粉水解糖的制备淀粉水解糖的制备几种水解方法的比较从时间上看：酸解法最快，酶解法最慢从原料转化率和糖液质量上看：酶解法酸酶法酶酸法酸解法不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大三、氮源物质氮源物质是培养基的主要成分之一。提供菌体结构物质，能源（少），含氮代谢产物。有机氮源：豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉、酵母粉、麦麸、鱼粉、玉米浆、蛋白胨、尿素等。成分复杂，除含蛋白质、多肽、氨基酸外，还含糖、脂、无机盐、维生素及其他生长因子，对菌体生长非常有利。无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐被吸收、利用快，但成分单一，常作辅助氮源。四、无机盐和微量元素无机盐：酶的激活剂，生理活性物质的组成，生理活性作用的调节剂。主要包括：P、Mg、S、Fe、K、Na、Pb、Cl、Zn、Co、Mn等。较低浓度对细胞的生长和产物合成有促进作用，而高浓度有抑制作用。不同菌种、不同生长阶段需求量不同。小试常加P、K、S、Mg、Fe例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟五、生长因子、前体和产物促进剂从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。1、生长因子如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子2、前体物质前体物质(Precursor)：最终所需的代谢产物的前身或其结构中的一部分。在生物合成中直接结合到产物分子中，自身结构变化不大，能显著提高产量的小分子物质。抗生素(Antibiotin)发酵中常用的前体物质：抗生素前体物质青霉素Ｇ苯乙酸（或在发酵中生成苯乙酸的物质）链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐影响前体物质效力的因素菌种的特性与菌龄(Cellage)前体物质的投入量(Inoculationconcentration)前体物质的毒性(Toxicity)苯乙酸用量（％）青霉素产量（单位/ml)青霉素Ｇ比例（％）0.1７７５０57.30.2８５１５73.00.3９６３０90.60.4９２００95.63、促进剂和抑制剂促进剂Accelerator（刺激剂Stimulant）并非前体或营养物，可影响正常代谢或中间代谢物积累、或提高次级代谢物的产量的一类刺激因子。作用原理：改变细胞的渗透性，或“启动”微生物体内的生产部位，否则这些部位是被阻遏的，因此促进剂的添加可以大大提高产量。常用促进剂：各种表面活性剂Surfactant（洗涤剂、吐温80、EDTA、植酸等）、大豆油提炼物、甲醇等抑制剂(Inhibitor)的作用原理：通过抑制某些合成其它产物的途径而使所需产物的合成得到加强。抗生素生产中的抑制剂：抗生素被抑制的产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖四环素金霉素溴化物、硫脲等头孢霉素C头孢霉素NL-蛋氨酸利福霉素B其它利福霉素巴比妥药物六、水分原生质的重要组分；优良溶剂；（物质进出细胞）维持大分子结构的稳定；参与生化反应；重要的物理性质：如：高比热；高汽化热；高沸点；冰的密度小于水等，保证生命活动的正常进行。其质量对产品质量影响很大。营养物质的调节培养基中各营养物的浓度和比例很严格。直接影响菌体的繁殖和产物的积累。尤其是碳氮比。（维持正常渗透压，节约原料也必需）1.不同碳源的利用速度2.氮源利用及碳源利用的关系3.碳氮比例的调节4.前体的控制5.补料一、不同碳源的利用速度不同菌能利用的碳源不同，同一菌种对不同碳源利用速度不同。如：青霉素产生菌利用葡萄糖快（30-40小时），利用乳糖速度慢（6天）。一般情况：单糖比双糖快；双糖比多糖快；纯多糖比杂多糖快（淀粉最好）。快者为速效碳源，慢者为迟效碳源。二、氮源利用及与碳源利用的关系不同氮源的利用速度也不同。如：铵盐比硝基氮更容易利用。氨及铵盐等氮源的利用速度常随碳源的利用速度而变。糖代谢中间产物是氨基酸的前体。氨浓度过高或过低，特别是过高，对某些产物（如：青霉素）的形成不利。三、碳氮比例的调节碳氮比能直接影响微生物的生长和发酵产品的积累。碳氮比严格讲指元素比，但通常指原料比。一般情况：产物不含氮，细菌，100:0.2-2.0；酵母菌，100:20；霉菌，100:10。产物含氮，碳氮比较高。如：谷氨酸生产，100:15-21。四、前体的控制同前体对不同菌作用不同；不同前体对同种菌作用不同；同前体，同种菌，使用不同，效果不同。一般前体越多，增产越多；但大多毒性也增大。所以应该少量（0.05-0.1％），多次（1次/12小时）。同时要注意前体物质被作为营养物质利用。五、补料补料解决的问题：菌体早衰；料粘，搅拌能耗高，消泡难，溶氧降低，渗透压高。补料有利于：丰富培养基；产物合成旺盛期延长；控制PH和代谢方向；补足发酵液体积。补料的目的和方法：限制生长速度；仅维持呼吸，半饥饿状态，利于产物合成；控制好时间、速率和配比。培养基的类型培养基的类型分类依据类型营养物质来源天然、合成、半合成培养基物理状态液体、固体、半液体培养基的成分和目的基本、完全、鉴别、选择生产工艺的要求孢子(Spore)、种子、发酵培养基的用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产等一、按营养物质来源1、天然培养基这是一种利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培养基，人们无法确切知道其中成分。优点：取材方便，营养丰富，种类多样，配制方便。缺点：成分不稳定也不清楚。一、按营养物质来源2、合成培养基又称组成培养基或综合培养基。是一类用多种高纯化学试剂配制成的，各成分的量都确切知道的培养基。优点：成分精确，重演性高。缺点：价格较高、配制麻烦。一、按营养物质来源3、半合成培养基是一种既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。又称半合成培养基。琼脂未经处理的组合培养基也视为半组合培养基。优缺点：成分精确性、重演性、价格、配制等介于合成培养基和天然培养基之间。二、按培养基物理状态1、液体培养基：呈液体状态的培养基。用于：大规模工业生产；实验室摇瓶试验；生物生理代谢研究。二、按培养基物理状态2、固体培养基：用于菌种培养、分离、保存，育种。A.固化培养基：液体培养基中加入适量凝固剂，如：斜面、平板；B.天然固体培养基：天然固态基质直接配置。如：孢子培养，药用、食用真菌生产。二、按培养基物理状态3、半固体培养基：介于固态和液态之间（加0.5%左右琼脂）的培养基。用于菌种鉴定、细菌运动性观察和噬菌体效价测定；厌氧菌培养、保藏。三、按培养基的成分和目的1、选择性培养基：就是根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是从混合菌样本中的选取优势菌，从而提高该菌的筛选效率。1)加富性选择培养基：用作加富的营养物主要是一些特殊的碳源或氮源，如甘露醇、纤维素、石蜡油、糖液等。2)抑制性选择培养基：选择性抑制剂有染料、抗生素、脱氧胆酸钠、叠氮化钠等。用于选择性的其他理化因素还有温度、氧、pH和渗透压等。三、按培养基的成分和目的2、鉴别性培养基培养基中加有能与某一菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。最常见的鉴别性培养基是伊红美蓝乳糖培养基，即EMB培养基。四、按生产工艺的要求1、孢子(Spore)培养基：固体；营养不太丰富（尤其是氮源）；适当的无机盐浓度；适当的PH和温度；分天然和半合成两种类型。四、按生产工艺的要求2、种子培养基：液体；常用速效C、N源；P较高；PH稳定；尽量接近发酵培养基。四、按生产工艺的要求3、发酵培养基：液体；营养丰富，完全；C、N源迟速搭配；应注意C:N、PH、生长因子、前体等。一、培养基成分选择的原则菌种的同化能力代谢的阻遏和诱导合适的C、N比100∶0.2～2.0pH的要求培养基的设计和优化（一）、理论转化率与实际转化