第五章-灭菌与除菌

第五章灭菌与除菌生物教研室贺气志[e-mail]第一节常用的灭菌方法第二节培养基与发酵设备的灭菌（重点）第三节空气的除菌（重点）第四节无菌检查与染菌的处理第一节主要的灭菌和除菌方法灭菌：用物理或化学方法杀灭或除去所有活的微生物及其孢子的过程。消毒：只杀死病原微生物，不一定杀死芽孢。除菌：用过滤方法除去空气或者液体中的所有微生物及其孢子常见灭菌方法的比较第二节培养基与发酵设备的灭菌最常用的方法：湿热灭菌，效果最好；培养基灭菌的基本要求：杀死培养基中混杂的微生物，再接入纯菌以达到纯培养的目的。（一）培养基湿热灭菌原理1.微生物的热阻温度超过最高限制，细胞中的原生质体和酶的基本成分-蛋白质发生不可逆的凝固变性，M-死亡-----湿热灭菌的依据。微生物对热的抵抗力常用“热阻”表示，热阻：微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）的致死时间；相对热阻：微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。微生物名称大肠杆菌细菌芽孢霉菌孢子病毒相对抵抗力130000002~101~52.微生物的热死定律-对数残留定律实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：N：任一时刻的活细菌浓度（个/L）t：时间（min）K-反应速率常数（随微生物的种类和加热温度而变化）1NkdtdN对上式进行积分：20KteNN1k两边取对数：t=㏑N0Nt上式是计算灭菌的基本公式，即对数残留定律。在灭菌过程中需考虑两个问题：一是一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据；二是灭菌程度，即残留菌数，一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中有一次失败。3.反应速率常数k是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度而异。T相同，k值越小，则微生物越是耐热。同一种微生物在不同灭菌温度下，k值不同，灭菌温度越低，k值越小，温度越高，k值增大。细菌芽孢名称k值/min-1枯草芽孢杆菌FS52303.8~2.6硬脂嗜热芽孢杆菌FS15180.77硬脂嗜热芽孢杆菌FS6172.9产气梭状芽孢杆菌PA36791.8121℃某些细菌芽孢的k值反应速率常数k与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示：K=AeERT-A-比例常数；E-杀死细胞所需的活化能，×4.18J/mol；T-绝对温度K；R-气体常数，1.987×4.14J/mol·K。（二）灭菌温度和时间的计算和选择1.杀灭细菌芽孢的温度和时间温度/℃100110115121125130时间/min120015051156.42.4杀灭细菌芽孢的温度和时间需根据试验决定。大多数细菌芽孢的杀灭温度和时间100105110115120125130134炭疽杆菌2~55~10枯草杆菌数小时40腐化厌氧菌78017041155.6破伤风梭菌5~905~25韦氏梭菌5~455~2710~1541肉毒梭菌300~53040~12032~9010~404~20土壤细菌数小时420120156~3041.5~10嗜热细菌400100~3004~11011~153.9~8.03.51生孢梭菌1504512温度℃芽孢名称灭菌时间某些细菌芽孢在湿热灭菌时的死亡温度和时间2.培养基灭菌温度的选择在生产中必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。培养基营养成分的分解的动力学方程符合一级分解反应动力学：-dC/dt=k’C㏑（C/C0）=-K’t-dC/dt-营养物降解速率，mol/L·h；C-营养物浓度，mol/L；K’-营养物降解反应速率常数，l/s；t-时间，s。在化学反应中，其他条件不变时，则反应速率常数的关系同样可用阿雷尼乌斯方程式表示：K’=A’e-E’/RTA’-比例常数；R-气体常数，J/mol·K；T-绝对温度；E’-营养物破坏所需的活化能，J/mol随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加的倍数，即杀死微生物速率的提高超过培养基成分破坏速率的增加，达到相同的灭菌效果时，Tkt，因此采用高温短时（HTST）灭菌效果好。（三）影响培养基灭菌效果的因素除了灭菌时间和温度外，还有：1.培养基成分培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越高，微生物的热死亡速率就越慢。高浓度的盐类、色素等的存在会削弱微生物细胞的耐热性，故一般较易灭菌。如：E.coli：在水中加热60~65℃10min就死亡；在10%的糖液中，需70℃4～6min；在30%的糖液中，需70℃30min2.培养基的物理状态固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大，灭菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于1mm的颗粒培养基，不必考虑颗粒对灭菌的影响，但含有少量大颗粒和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以防止培养基结块而造成灭菌不彻底。3.pH培养基的pH越低，灭菌所需的时间就愈短，pH6~8时，微生物最耐热；pH6，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变微生物的生理反应促使其死亡。4.培养基中微生物数量微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长。培养基中微生物孢子数/（个/ml）9900900009000000900000000105℃灭菌所需时间/min214203648培养基中微生物孢子在105℃灭菌所需时间在实际生产中，不宜采用严重霉变的原料和腐败的水质。5.微生物细胞含水量含水量越少，灭菌时间越长。水分（%）50251860凝固温度℃5674~7880~92145160~170卵蛋白凝固时水分与温度的关系6.微生物的菌龄微生物细胞的菌龄不同对高温的抵抗力不同，年老的细胞对不良环境的抵抗力要比年轻细胞强，7.微生物的耐热性各种微生物低热的抵抗力是不同的：细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感；放线菌、酵母、霉菌孢子比营养细胞的抗热性要强，细菌的芽孢的抗热性就更强。8.空气排除情况温度罐内的蒸汽压力9.搅拌灭菌过中，培养基在罐内保持均匀充分翻动，除搅拌外，还必须正确控制进排汽阀门，保持在一定温度和罐压，是灭菌的要点之一。10.泡沫泡沫对培养基灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔层，使热量难易传递，热量难易渗透进去，不易达到微生物的致死温度，导致灭菌不彻底；泡沫的形成主要是由于进排气不均衡而致。第二节发酵培养基灭菌工艺（一）间歇灭菌1.间歇灭菌的温度变化间歇灭菌也叫分批灭菌或实罐灭菌。培养基的间歇灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程。2.间歇灭菌的计算若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间。例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121℃下进行实罐灭菌。原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速率常数为1.8min-1，求灭菌失败概率为0.001时所需要的灭菌时间。解：N0=40×106×2×105（个）Nt=0.001（个）k=1.8min-1㏑灭菌时间：t=N0Nt1k=2.3031.8㏒（8×1015）=20.34（min）3.间歇灭菌的工艺操作操作过程：空罐准备：清洗、检修和检测。升温：把培养基加热到灭菌所需的温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度。三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气分批灭菌设备示意图优点：不需要专门的设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，而且灭菌效果可靠。（二）连续灭菌1.连续灭菌的温度变化培养基的连续灭菌就是将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图2.连续灭菌的计算连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。例：发酵罐内装40m3培养基，在温度131℃下进行连续灭菌。原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢，131℃时灭菌速率常数为15min-1，求所需要的灭菌时间。解：c0=2×105（个/ml）ct=1/40×106×103=2.5×10-11（个/ml）k=15min-1㏑灭菌时间：t=C0Ct1k=2.30315㏒（）=2.37（min）2×1052.5×10-113.连续灭菌的工艺流程①配料预热罐：预热到60~70℃，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声音。②连消塔：使高温蒸汽与料液迅速解除混合，使料液温度很快上升到灭菌温度（126~132℃）套管式连消塔③维持罐：使料液在灭菌温度下保持5~7min，以达到灭菌目的；④冷却管：生产上一般采用冷水喷淋冷却到40~50℃后，输送到预先灭菌过的罐内。典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图喷射加热连续灭菌流程（三）间歇灭菌和连续灭菌的比较灭菌方式优点缺点连续灭菌1.灭菌温度高，减少营养物质损失2.操作条件恒定，灭菌质量稳定3.易于实现管道化和自控操作4.避免反复加热和冷却，提高热的利用率5.发酵设备利用率高1.对设备要求高，需要设置加热和冷却装置2.操作麻烦3.染菌的机会多4.不适合含大量固体物料的灭菌5.对蒸汽的要求高间歇灭菌1.设备要求低，不需另外设置加热好冷却装置2.操作要求低，适于手动操作3.适合于小批量生产4.适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌1.培养基营养物质损失多，灭菌后培养基质量下降2.需要反复的加热和冷却，能耗较大3.不适于大规模生产过程的灭菌4.发酵罐的利用率低三、培养基和设备、管路灭菌的条件1.杀菌锅内培养基灭菌固体培养基灭菌蒸汽压力0.098Mpa，维持20~30min；液体培养基灭菌蒸汽压力0.098Mpa，维持15~20min；玻璃器皿及用具灭菌蒸汽压力0.098Mpa，维持30~60min2.种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐及管道灭菌从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147Mpa。维持45min，灭菌过程从有关阀门排出空气，并使争取通过达到死角灭菌；灭菌结束，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098Mpa。3.空气总过滤器和分过滤器灭菌排出过滤器中空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从下、下排气口排气，维持压力0.147Mpa，灭菌2h，灭菌完毕通入压缩空气吹干。4.种子培养基实罐灭菌从夹层通入蒸汽间接加热至80℃，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时，关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121℃，维持30min，谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110℃，维持10min。5.发酵培养基实罐灭菌从夹层或盘管通入，蒸汽间接加热至90℃，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时，关闭夹层蒸汽进口阀门，升温121℃，维持30min，谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为105℃，维持5min。6.发酵培养基连续灭菌一般培养基为130℃，维持5min，谷氨酸发酵培养基为115℃，6~8min。7.消泡剂的灭菌直接加热至121℃，维持30min。8.补料实罐灭菌根据料液不同而异，淀粉料液为121℃，维持5min。9.尿素溶液灭菌105℃，维持5min。第三节空气除菌（净化）发酵对空气无菌程度的要求一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3。•空气中微生物(包括细菌、酵母、霉菌和病毒)含量一般为103~104个／米3。一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上。•灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，空气除菌主要去除空气中的微粒(0.6~1μm）。一、空气除菌的方法（一）辐射杀菌（二）热杀菌（三）静电除菌（四）过滤除菌二、空气过滤除菌的原理与介质1.过滤除菌的种类绝对过滤：过滤介质的滤孔小于细胞和孢子。如聚乙烯醇缩甲醛树脂（PVF）制成的0.3m的微孔滤膜。深层介质过滤：介质的孔隙一般大于微生物细胞