4第四章-培养基1已

1第四章培养基第一节概述第二节培养基的成分及来源第三节培养基的设计与优化第四节影响培养基质量的因素2第一节概述一、培养基的概念1、培养基是指人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。广义上讲培养基是一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物提供除营养外的其它所必需的条件，工业生产上选择的培养基俗称发酵培养基，还应包括能够促进微生物合成产物所必须的成分。32、培养基条件与微生物生理学和形态学的相关性培养基的组成还可改善细胞的通透性。谷氨酸发酵中，生物素的用量影响谷氨酸产量，如果控制了生物素浓度在亚适量，就可以增加产生菌的细胞膜通透性，使谷氨酸连续分泌到细胞外，这就解除了谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的反馈抑制作用，提高了谷氨酸的产量。青霉素能抑制革兰氏阳性菌细胞壁合成过程中肽聚糖交联，导致菌体细胞膨胀，亦可使谷氨酸易于泄漏到培养基中，提高谷氨酸产量。4培养基条件：是指培养基组成、pH值、二价阳离子、阴离子聚合物、表面活性剂和固形物含量等。53、配制工业发酵培养基时的一般要求①营养物质的组成比较丰富，浓度恰当，能满足菌种发芽和生长繁殖成大量的有生理功能的菌丝体之需要，更重要的是能显示出产物合成的潜力②在一定条件下，所采用的各种原材料彼此之间不能产生化学反应，理化性质相对稳定；③粘度适中，具有适当的渗透压；④要考虑所选用的原材料的品种和浓度与代谢产物生物合成过程中的调节关系，要利于主要产物的生物合成并能维持较长时间的最高生产速率，不需要的产物的合成速率降至最低⑤生产过程中，既不影响通气与搅拌的效果，又不影响或稍影响产物的分离精制和废物处理⑥选用的原材料尽量做到因地制宜，质优价廉，成本低。6二.培养基的类型及功能1.按组成成分分类，分为合成培养基和天然培养基(复合培养基)。合成培养基：由已知组成成分的各种营养物质组合的培养基，主要用于科学研究。所用的原料其化学成分明确、稳定，比如药用葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾等。天然培养基：由一些组成成分不完全明确的天然产物如黄豆粉、蛋白胨等，与一些无机盐组合的培养基叫天然培养基（复合培养基或半合成培养基），常用于发酵生产。其特点是营养丰富、适于微生物的生长。72.按状态分类固体培养基比较适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产。半固体培养基是在配好的液体培养基中加入少量的琼脂，一般用量为0.5%～0.8%，培养基呈半固体状态，主要用于鉴定细菌、观察细菌运动特征等。液体培养基80%～90%是水，其中含有可溶性的或不溶性的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。83.按生产中的用途分类孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并且不易引起菌种发生变异。种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮，成为活力强的“种子”。营养成分应是易被菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为宜，以便菌体的生长繁殖。发酵培养基是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。9发酵培养基例子代谢产物衣康酸赤霉素核黄素青霉素培养基甘蔗糖蜜，150g/LZnSO41.0g/LMgSO43.0g/LCuSO40.01g/L葡萄糖，20g/L；MgSO4，1.0g/L；NH4NO3，1.0g/L；KH2PO4，5.0g/L；FeSO4∙7H2O，0.01g/L；MnSO4∙4H2O，0.01g/L；ZnSO4∙7H20，0.01g/L；CuSO4∙5H2O，0.01g/L；玉米浆（干固形物），7.5g/L大豆油，20mL/L；甘油，20mL/L；葡萄糖，20g/L；玉米浆，12mL/L；酪蛋白，12g/L；KH2PO4，1.0g/L葡萄糖或糖蜜，总量的10％；玉米浆，总量的4％～5％；苯乙酸，总量的0.5％～0.8％；猪油或植物油；消泡剂，总量的0.5％10第二节培养基的成分及来源碳源、氮源、无机盐及微量元素、水、其它成分1.碳源凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。生产中常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、低碳醇和其它碳氢化合物等。11(1)糖类主要有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉糊精等。(2)油和脂肪也能被许多含有比较活跃的脂肪酶的微生物（如许多霉菌和放线菌）作为碳源和能源。(3)有机酸及其盐类，一些微生物对许多有机酸(如乳酸、柠檬酸、乙酸等)及其盐类有很强的氧化能力，因此有机酸和它们的盐也能作为微生物的碳源。(4)烃和醇类近年来随着石油工业的发展，烷烃(石油裂解而得)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工业发酵中。甘油、甲醇、乙醇、山梨醇等也用于发酵碳源或生产某些单细胞蛋白。12碳源来源葡萄糖纯葡萄糖，水解淀粉乳糖纯乳糖，乳清粉淀粉大麦，玉米粉，燕麦粉，黑麦粉，土豆淀粉等蔗糖甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红糖，精白糖等13酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。甲醇可作为底物生产单细胞蛋白（SCP）用烷烃可进行有机酸、维生素等的生产142.氮源氮源是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。它是微生物发酵中使用的主要原料之一。其主要功能是构成微生物细胞和含氮的代谢产物，当培养基中碳源不足时，可作为补充碳源。分为有机氮源和无机氮源。无机氮源：氨水，铵盐，硝酸盐等有机氮源：玉米浆，豆饼粉，花生饼粉，棉籽粉，鱼粉，酵母浸出液等15（1）有机氮源有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉（全脂、低脂和脱脂）、棉籽饼粉（低温榨取和高温榨取）、玉米浆（玉米淀粉的副产物，有干玉米浆和液态玉米浆）、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等，它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。16微生物在有机氮源的培养基中，可以直接利用游离氨基酸或其他有机化合物的碳架，合成用于构成细胞的蛋白质和其他细胞物质。微生物对氨基酸的利用是有选择性的，如①缬氨酸既可用于红霉素链霉菌的生长，又可以氮源的形式参加红霉素的生物合成。②在螺旋霉素发酵中，发酵培养基里加入L-色氨酸可使螺旋霉素的产量显著提高，但L-赖氨酸则完全抑制螺旋霉素的生物合成。③另外，有机氮源中含有的某些氨基酸是菌体合成次级代谢产物的前体。如α-氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸是合成青霉素和头孢菌素的直接前体，玉米浆中含有的苯乙胺和苯丙氨酸有合成青霉素G的前体作用。色氨酸是合成硝吡咯菌素和麦角碱的前体。17工业上常用的有机氮源及含氮量（质量分数/%）氮源含氮量氮源含氮量大麦1.5～2.0花生粉8.0甜菜糖蜜1.5～2.0燕麦粉1.5～2.0甘蔗糖蜜1.5～2.0大豆粉8.0玉米浆4.5乳清粉4.518（2）无机氮源常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水等，因为微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称为迅速利用的氮源。(NH4)2SO4→2NH3+H2SO4NaNO3+4H2→NH3+2H2O+NaOH经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质；代谢后能产生碱性物质的无机氮源叫生理碱性物质。19氨水除了作为氮源之外，还可以调节pH，在许多抗生素的生产中普遍使用，例如链霉素和红霉素的生产中。氨水添加时要加强搅拌，少量多次。在氨水中还含有多种嗜碱微生物，因此在使用前应用石棉等过滤介质进行除菌过滤。203.无机盐及微量元素微生物在生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和微量元素，如磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等。其中许多金属离子对微生物生理活性的作用与其浓度相关，低浓度时往往呈现刺激作用，高浓度则表现出抑制作用。在培养基中，磷、硫、镁、钙、钾、钠、氯等常以盐的形式加入，而钴、铜、铁、锰、锌、钼等因需要量很少，除了合成培养基，一般复合培养基中不另外单独加入。213.无机盐及微量元素无机盐是微生物活动不可缺少的物质。其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养渗透压、调节pH值和Eh等。微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。•磷酸盐磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。工业上常用K3PO4•3H2O、K3PO4和Na2HPO4•12H2O、NaH2PO4•2H2O等磷酸盐，也可用磷酸。22硫酸镁①除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成；②处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂；③不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成23钾盐①钾离子与细胞渗透压和透性有关；②是许多酶的激活剂；微量元素①Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂；②一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加；③特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴24铁是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌体生命活动必需的元素之一。但在发酵培养基中铁离子的含量对多种代谢产物的生物合成有较大的影响。在青霉素、四环素、麦迪霉素等发酵中，Fe2+含量高都显示较强的抑制作用，抗生素产量显著下降。因此，铁制发酵罐在正式投产之前，需用稀硫酸铵或稀硫酸溶液预处理几次，再用未接种的培养基运转几批，进一步去除罐壁上铁离子，然后才能正式投入生产。254.水水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。水源质量的主要考虑参数包括：pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。生产中使用的水有深井水、自来水、地表水。也可以通过物理和化学的方法得到去离子或脱盐的工业用水。26275.其它成分(1)生长因子生长因子:多种微生物除了需要碳源、氮源、无机盐和水以外，还必须补充微量的有机物才能生长或生长良好。这些微生物生长所不可缺少并且不能用简单的碳源和氮源合成的微量有机物就是生长因子。生长因子包括维生素、氨基酸、碱基（嘌呤碱、嘧啶碱）、固醇、胺类等。28含生长因子的天然物质有酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、玉米浆、动植物组织或细胞的浸出液等。有机氮源是生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素以及一些微生物生长不可缺少的生长因子，比如玉米浆。绝大多数生长因子以辅酶或辅基的形式参与代谢过程中的酶促反应，少数还具有其他功能（见下表）。29表几种生长因子的主要功能生长因子主要功能维生素B1脱羧酶、转醛酶、转酮酶的辅基维生素B2黄素蛋白的辅基，与氢的转移有关维生素B6辅基，与氨基酸的脱羧、转氨基有关生物素各种羧化酶的辅基维生素B12钴酰胺的辅酶，与甲硫氨酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成和异构化有关叶酸辅酶F，与核酸的合成有关泛酸乙酰载体的辅基，与酰基转移有关维生素K电子传递尼克酸脱氢酶的辅基30315.其它成分(2)前体前体是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化的物质，但是产物的产量却因此有较大的提高。（第二章已讲过）在实际生产中前体的加入还可以显著提高产物中目的成分的比重，比如在青霉素生产中加入苯乙酸可生产青霉素G，而用苯氧乙酸作为前体则可生产青霉素V。32有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率。33抗生素发酵常用的前体物质抗生素前体物质抗生素前体物质青霉素G苯乙酸或在发酵中能形成苯乙酸的物质，如苯乙基酰胺等金霉素氯化物青霉素O烯丙基－硫基乙酸溴四环素溴化物青霉素V苯氧乙酸红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐、乙酸盐放线菌素C3肌氨酸灰黄霉素氯化物链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸34氨基酸发酵的前体物质氨基酸菌体前体物质产量/%丝氨酸嗜甘油棒状杆菌甘氨酸1.6色氨酸异常汉逊酵母氨茴酸0.