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包头轻工职业技术学院生物制药的生产工艺主讲人：杨紫团队人员：张鑫、汪洋知识目标：掌握ß-内酰胺类抗生素的理化性质掌握发酵生产青霉素的条件控制，及青霉素提取与精制的控制点。能力目标：通过实训，熟悉工业生产青霉素的工艺流程并熟悉基本操作重点:掌握发酵生产青霉素的工艺流程难点:青霉素提取与精制的控制点青霉素青霉素又被称为青霉素G、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾等。青霉素是抗菌素的一种，能破坏细菌的细胞壁（革兰氏阳性菌）并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。青霉素是β-内酰胺类抗生素的典型代表。青霉素结构ß-内酰胺类抗生素是分子中含有ß-内酰胺环的一类天然和半合成抗生素的总称。作用机制细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物临床应用（1）临床抗感染治疗：大多数革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体等。毒性小，但需要皮试。（2）各种半合成抗生素的原料：氨苄青霉素，磺苄青霉素，乙氧萘青霉素，头孢菌素母核。青霉素的性质1、稳定性固体青霉素盐的稳定性与其含水量和纯度有很大的关系；2、溶解度青霉素游离酸在水中溶解度很小，易溶于有机溶剂如醋酸乙酯、苯、氯仿、丙酮和乙醚中，而其钾盐、钠盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇3、降解反应：青霉素是很不稳定的化合物，遇酸碱或加热易分解而失去活性，并发生分子重排。4、紫外吸收5、过敏反应青霉素生产菌的生物特性：产黄青霉：Penicilliumchrosogenum孢子:绿色和黄色菌落：平坦或皱褶，圆形青霉穗:分生孢子链状深层培养菌丝：球状和丝状两种。青霉素发酵工艺1.发酵工艺流程（a）最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，生产能力很低，不能满足工业生产要求，所以被淘汰。现在主要采用的的产黄青霉菌。（b）为了提高产黄青霉的青霉素产量使用的诱变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、X射线等。（1）菌种：（2）孢子制备将沙土孢子先在用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的培养基进行斜面培养，经传代活化。最适生长温度25~26ºC，培养6~8天，得单菌落，再传斜面，培养7天，制得斜面孢子。再移植到优质小米或大米固体培养基上，25ºC，相对湿度45%-50%，生长7天，制得小米孢子。孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油消沫剂等；接种量:200亿孢子/t培养基空气流量:1：3（m3/m3·min）；搅拌转速:300-350r/min；pH:自然；温度：25±0.5℃；时间:68h。二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等；接种量：10％；空气流量：1:1-1.5（m3/m3·min）；搅拌转速：250-280r/min；pH：自然；温度：25±1℃；时间：180-193h；生产罐培养工艺三级罐：生产罐；培养基：花生饼粉，葡萄糖，硫酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3,玉米油.温度控制适宜菌丝生长温度一般为25ºC，分泌青霉素20℃20℃青霉素破坏少，周期很长。变温控制，不同阶段不同温度。生长阶段:较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，以利于青霉素合成。前期控制25℃左右，后期降温控制22℃pH控制合成适宜pH6.4－6.6左右，避免超过7.0直接加酸或碱：自动控制流加葡萄糖：恒速；变速，依赖pH变化快慢。pH下降：补加CaCO3、通氨、尿素或提高通气量pH上升：补加糖、生理酸性物质（硫酸铵、油脂）恒速补糖，用酸或碱控制方式根据pH补糖溶氧控制＜30％饱和度，产率急剧下降；＜10％，造成不可逆的损害。临界溶氧浓度：30％。通气比：1：0.8－1.5。适宜的搅拌速度:保证气液混合，提高溶氧各阶段的供氧比较一级种子阶段二级种子阶段发酵阶段空气流量（m3/m3·min）1：31:1-1.51：0.8－1.5搅拌转速（r/min）300-350250-280150-200菌丝生长速度与形态、浓度发酵稳定期，湿菌浓度可达15%~20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。在发酵中后期一般每天放一次，每次放掉总发酵液的10%左右。消沫天然油脂：玉米油前期:主间歇搅拌,少加油中期:搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时）策略：少量多次。后期:尽量少加消沫剂青霉素的发酵过程控制十分精密，一般2小时取样一次，测定发酵液的ＰＨ、菌浓、残糖、青霉素效价等指标，同样取样做无菌检查，发现染菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后ＰＨ波动大，青霉素在几个小时内就会被全部破坏。提炼工艺过程１．青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活２．水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定３．易溶于有机溶剂，水中溶解度很小４．青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性５．防止降解，条件温和、快速。预处理青霉素的存在部位：发酵液浓度较低：10－30Kg/M3含有大量杂质：菌体细胞、核酸、杂蛋白质、细胞壁多糖等、残留的培养基、色素、盐离子、代谢产物等目的：浓缩目的产物，去除大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程。预处理:发酵液加少量絮凝剂沉淀蛋白过滤鼓式真空过滤机过滤：一次滤液：pH6.2-7.2，略浑，棕黄或绿色，蛋白质含量0.5-2.0%。板框式过滤机过滤：硫酸调节pH4.5-5.0，加入0.07%溴代十五烷吡啶，0.07%硅藻土为助虑剂。二次滤液：澄清透明，用于提取（收率90％）溶剂萃取原理：青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而霉素盐易溶于水。萃取剂：青霉素分配系数高的有机溶剂。工业上通常用：醋酸丁酯和醋酸戊酯。除去蛋白质：加0.05-0.1%乳化剂PPB。萃取：2－3次。逆流萃取过程正相萃取：酸化pH1.8-2.0，滤液：醋酸丁酯＝1：0.3，碟片式离心机分离（浓缩1.5-2.1）反相萃取：pH6.8-7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液中。反复萃取2－3次，达到结晶要求。萃取条件：10℃下。萃取罐冷冻盐水冷却。脱色1.萃取液中添加活性炭，除去色素。2.过滤，除去活性炭。结晶——直接结晶加醋酸钠－乙醇溶液反应：得到结晶钠盐。加醋酸钾－乙醇溶液：得到青霉素钾盐。薄膜蒸发工艺图结晶——共沸蒸馏结晶萃取液，再用0.5MNaOH萃取pH6.4-6.8下得到钠盐水浓缩液。加3-4倍体积丁醇，16-26℃，真空0.67-1.3KPa）下蒸馏。水和丁醇形成共沸物而蒸出。钠盐结晶析出。结晶经过洗涤、干燥（60℃真空16h），磨粉，装桶，得到青霉素产品。河南新乡华星药厂山东鲁抗医药股份有限公司联邦制药（内蒙古）有限公司浙江司太立制药有限公司佛山市顺德区海正药业有限公司江西东风药业股份有限公司四川制药股份有限公司山东宇辉药业有限公司武汉远城化工原料有限公司