从后处理工艺提高植酸酶热稳定性的研究进展

1从后处理工艺提高植酸酶热稳定性的研究进展刘梅英彭健刘敏跃高雁植酸酶渊Phytase冤即肌醇六磷酸水解酶渊Myoinosi鄄tolhexaphosphatephosphohydrotase冤袁是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸渊或磷酸盐冤的一类酶的总称渊Ullah袁1996冤遥在猪与家禽饲料中添加植酸酶可以使植物性饲料中磷的利用率提高60%袁粪便中磷的排泄量减少40%左右曰同时还能提高蛋白质尧微量元素等的吸收利用遥然而在植酸酶的生产应用中一直存在着植酸酶的热稳定性问题袁它直接关系到植酸酶的有效性和添加量袁且成为当前植酸酶在动物饲料中推广应用的限制性因素之一遥1影响植酸酶热稳定性的主要因素1.1植酸酶菌株生产植酸酶的微生物来源不同袁其最适作用温度尧pH值范围尧热稳定性等理化性质也不同遥MarkusWyss(1998)报道袁在制粒温度75益时袁烟曲霉植酸酶及黑曲霉植酸酶的活性均为63%耀73%曰在85益制粒温度时袁烟曲霉植酸酶活性保留51%袁黑曲霉为31%遥说明不同来源的植酸酶耐热性差异较大遥烟曲霉产生的植酸酶是目前已知的同类酶中热稳定性最好的袁经100益处理20min仍有90%的活性渊LuisPasamontes等袁1997冤袁因此成为工业化生产耐热性植酸酶的良好的候选基因遥1.2高温猪与禽饲料一般需经历制粒工序袁其中温度高达70耀90益袁饲料中的水分高达15.5%耀17.5%袁调质时间为6耀15s渊邱万里袁2002冤遥在制粒温度为90益时袁黑曲霉植酸酶的活性低于10%耀20%渊BASF袁1996冤遥Si鄄mons等(1990)研究袁发现无花果曲霉植酸酶调质温度50益尧制粒温度78益袁活性保留96%袁而在调质温度和制粒温度提高到60益尧87益时袁活性保留只有46%袁因此制粒过程中的高温导致许多市售的植酸酶活性降低遥1.3高湿制粒过程中的水分是影响植酸酶热稳定性的一个非常关键的因素渊宰ard袁2002冤遥Clemmensen等(1999)报道植酸酶去折叠温度与水分高度相关遥完全干燥的植酸酶的去折叠温度为165益曰添加12%的水分袁去折叠温度迅速降为95益曰添加16%的水分袁去折叠温度降为88耀90益遥可见高湿对植酸酶热稳定性的影响也不容忽视袁在改善植酸酶热稳定性时应同时考虑改善酶的耐干热性和耐湿热性遥1.4植酸酶产品的剂型植酸酶菌株经发酵后得到发酵液袁发酵液经不同的后处理工艺可得到不同剂型的植酸酶产品袁有液体酶尧粉酶尧普通颗粒酶和包被型颗粒酶渊如图1所示冤遥液体酶的热稳定性差袁但它是在制粒后喷涂在颗粒饲料表面袁因此避免了制粒的湿热处理过程遥粉酶由于完全暴露在湿热环境中袁所以其热稳定性较差遥普通颗粒酶相当于将植酸酶分子封闭在若干的小区内袁隔离了分子与外界的接触袁一定程度上提高了植酸酶的热稳定性遥包被型颗粒酶的热稳定性最好袁因为其表面有一层坚固而易溶的薄膜包衣袁它使植酸酶颗粒与外界的空气和水分隔离袁更利于植酸酶的稳定袁提高了植酸酶的耐高温水平遥Ward(2001)研究商品饲料中植酸酶RonozymePTMCT(RCT)在制粒过程中的稳定性遥RCT是一种薄层油脂包被的植酸酶袁在水分为16%耀17%袁制粒温度为73耀99益时袁其活性存留率为68%~90%遥发酵液离心超滤液体酶载体吸附喷雾干燥粉酶造粒圆整干燥颗粒酶包被包被酶图1植酸酶的后处理工艺流程刘梅英，华中农业大学工程技术学院，博士，430070，武汉。彭健（通讯作者），华中农业大学动物科技学院。刘敏跃、高雁，辽宁省农牧业机械研究所。收稿日期：2007-03-26《饲料工业》·圆园园7年第圆8卷第11期工艺设备22从后处理工艺提高植酸酶热稳定性的措施2.1添加稳定剂2.1.1盐盐的添加能显著改善酶的热稳定性袁因盐类主要存在离子键作用袁当酶的活性中心含有离子作为配位体时袁盐离子就能稳定酶的构象遥另外袁盐可作为水分子的替代物占据水的位置袁排除自由水对酶造成的不稳定化影响渊专利EP0758018A1冤遥盐的种类和浓度会影响到植酸酶的热稳定性遥Igamnazarov等渊1999冤研究金属离子对胞外植酸酶BacteriumSP.活性的影响袁发现Ca2+和Mg2+在低浓度渊0.5耀1.0mmol/l冤时是激活剂袁然而Cu2+和Fe3+在低浓度时却是抑制剂袁且Cu2+是一种竞争性抑制剂袁而Fe3+是一种非竞争性抑制剂遥段学辉渊2003冤在甲醇酵母植酸酶液中添加CaCl2袁在80益处理20min时袁加入10mmolCaCl2的酶液的相对酶活为70.1%袁而加入5mmolCaCl2的酶液的相对酶活为54.8%袁原酶液的相对酶活低于5%遥据报道袁阴离子的稳定化作用是SO42-Cl-Br-NO3-袁阳离子是渊CH3冤4N+NH4+K+尧Na+Mg2+Ca2+Ba2+袁因此一般采用的无机盐有MgSO4尧渊NH4冤2SO4尧CaSO4尧CaCl2尧MgCl2尧NaCl等遥专利EP0758018A1描述了用盐来稳定固态植酸酶袁二价阳离子效果更好袁无机盐与酶的质量比控制在5%~90%袁但实际上由于存在着盐析现象袁当盐浓度增加到一定量时袁酶蛋白会从溶液中析出袁因此如果实际需要量超过了盐析临界浓度袁可以考虑采用复合盐遥2.1.2多羟基化合物多羟基化合物既可通过氢键与酶蛋白表面分子相连结袁也能通过氢键有效地与外部水分子相连结袁使酶蛋白分子稳定袁它包括多羟基醇尧糖类等化合物遥多羟基醇有乙二醇尧甘油尧甘露醇尧木糖醇尧山梨醇等袁糖类有麦芽糖尧乳糖尧葡萄糖尧蔗糖尧海藻糖等遥陈惠等渊2004冤研究糖对植酸酶热稳定性的影响袁加入甘露醇尧葡萄糖尧海藻糖均能提高植酸酶在高温下的热稳定性袁与不加糖相比袁酶活力保留率提高10%左右袁其中以0.4mol/l海藻糖提高植酸酶热稳定的效果最好曰在植酸酶溶液中加入0.4mol/l海藻糖和0.4mol/l硫酸铵效果更好袁在75益处理5min袁能使酶活保留率达到72%遥苏东海渊2004冤研究不同浓度的糖在干热及湿热条件下对植酸酶活性的影响袁在干热情况下袁添加40mg/g海藻糖的效果最好袁蔗糖其次袁葡萄糖耐干热能力较差曰在湿热情况下袁三种糖在60mg/g酶浓度内对保留剩余酶活都有一定的作用遥专利WO93/16175描述了用尿素尧甘油或山梨醇等来稳定液态植酸酶遥因为液态植酸酶稳定性差袁其中水的活性非常高袁使得其中酶的活性非常高袁但颗粒植酸酶中水分活度较低袁其中的酶在动物消化之前基本无活性遥由于潮湿环境会使得液态酶的活性迅速降低袁把不同的液态酶制剂混合成野复合冶酶制剂袁以及在湿热环境中贮存液态酶制剂袁均能降低液态酶制剂的贮存稳定性(P.Steen袁2001)遥2.1.3其它稳定剂台湾学者Chang-ChihChen等(2001)研究发现在植酸酶溶液中加入可溶性淀粉和高粱糖浆废弃液渊SLW冤可以提高植酸酶的热稳定性遥植酸酶尧植酸酶与SLW以110渊v/w冤混合尧植酸酶与淀粉和SLW三者以1110(v/w/w)混合后袁在70益下加热30min袁残余酶活分别为0尧50%尧90%遥其原因可能是高粱糖浆废弃液和淀粉阻止了传热袁对酶起到了一定的保护作用袁但其保护机理还需进一步研究遥专利US6610519B1描述了来自玉米浆所生产的乳酸可以稳定固态植酸酶组分袁其示例均为贮藏稳定性袁添加1.5%玉米浆和3.8%小麦淀粉能显著提高贮藏稳定性袁该专利没有研究其对热稳定性的影响遥2.2筛选合适的载体所有酶在有底物存在时都很稳定袁这种作用被称为底物保护效应袁这一性质使得酶的生产者能够利用其提高酶产品的稳定性,即通过载体吸附酶液来提高酶制剂的稳定性(石永峰袁1997)遥选择载体时要考虑以下因素院淤载体与酶液的混合性能袁即载体的吸附能力或承载能力曰于载体对酶的活性影响曰盂载体对酶热稳定性的影响曰榆载体的化学稳定性及吸湿性遥此外袁由于载体所占比例较高袁还需考虑载体的经济性袁以降低生产成本遥目前吸附酶的载体主要有玉米芯粉尧面粉尧小麦麸尧小麦次粉和玉米酒糟粉等袁既可以选择单一的载体袁也可将不同的载体进行优化组合添加遥2.3包被技术包被型颗粒酶在饲料生产中还没有得到大范围推广应用袁其主要原因是生产成本高袁而且包衣材料的筛选尧包被工艺的确定尧包被效果的评定以及包被工艺设备刘梅英等：从后处理工艺提高植酸酶热稳定性的研究进展3酶在动物体内的应用效果评定等还没有系统尧成熟的研究遥包衣材料的选择很关键袁既要求其耐高温尧高湿袁而且在消化道能迅速释放被胃肠道利用袁同时要求酶活高袁加工成本低遥植酸酶包衣材料分为水溶性和脂溶性两类遥选用水溶性包衣剂可以保证在消化道中能快速溶解袁释放出其中的植酸酶袁但其耐湿尧热能力差遥选用脂溶性包衣剂袁比如各类脂肪或硬脂酸盐袁可以更有效地阻止湿热的传递袁但包衣需经脂肪酶的作用才能大量释放袁另外脂肪或硬脂酸盐在饲料中容易被氧化袁影响植酸酶的存留率遥包衣过程必须在表面形成坚固的膜袁具有防潮尧隔绝空气的作用袁这就要对包衣的时间尧工艺提出具体的要求遥1996年袁欧洲著名的酶制剂生产商NOVO和BASF公司采用包被型饲用植酸酶的生产工艺遥在植酸酶浓缩液中加入纤维素尧碳酸钙和糊精袁经混合尧挤压尧切割尧圆整尧低温干燥和筛分袁制成含酶小颗粒遥然后再涂抹由氢化牛油尧碳酸钙和高岭土组成的混合物袁低温干燥袁制成包被型含酶颗粒袁各组分配比见表1遥该包被型颗粒酶经调质温度85益处理30s袁酶活性保留率达到70%左右曰而对照组是未经包被的酶粉袁其酶活保留率仅为20%左右袁植酸酶的热稳定性得到了大幅度的提高遥表1植酸酶包被颗粒各组分及其分布（豫）项目核心区包被层高岭土7纤维素6碳酸钙547糊精+酶2氢化牛油11苏东海渊2004冤确定包被工艺优化条件为院以多孔淀粉为载体袁采用流化床干燥法取得曰包被中蔗糖的添加量为40mg/g袁氯化钠包覆用量为淀粉质量的10%袁明胶作外包被袁用量为淀粉质量的1.5%袁得到包埋颗粒袁其包埋率为82.8%遥包埋后袁水分活度大于0.35时袁包被酶在干热的情况下残存酶活性比原酶有较大的提高袁残存酶活性提高8.7%曰湿热的情况下残存酶活性提高58.3%遥由此可见袁采用包被技术提高植酸酶热稳定性的空间很大袁因此如何降低包被颗粒酶的生产成本袁提高包被技术及确定包被型颗粒酶的评定效果还值得深入尧系统的研究遥3小结目前提高植酸酶热稳定性已成为植酸酶研究的热点之一袁主要研究方法有自然选择法尧基因工程和蛋白质工程法尧改进植酸酶后处理工艺等遥自然选择法是从自然界中分离耐高温产植酸酶菌株遥该法虽然可以提高植酸酶的热稳定性袁但在37益时酶活往往较低遥基因工程和蛋白质工程法得到的植酸酶虽然耐热性有所提高袁但仍存在一些问题袁如需要高通量的筛选袁在37益下的酶活性极低袁底物特异性改变袁或者酶的其它性质发生改变等袁因此在饲料中暂时还没有应用价值袁需要进一步的深入研究遥从后处理工艺改善植酸酶热稳定性袁包括在处理酶液时添加稳定剂尧选择合适的载体及进行酶的包被处理等袁一般不会改变植酸酶的理化性质袁且具有开发期短尧成本低等优势遥笔者认为袁在重视提高植酸酶热稳定性的同时袁还需重视植酸酶品质渊如酶活尧热稳定性等冤的检测和体内应用效果的评定研究袁加快植酸酶的开发与应用袁充分发挥植酸酶的经济效益尧社会效益和生态效益遥参考文献1Chang-ChihChen,Ching-TsanHuang,etal.Improvementofphytasethermostabilitybyusingsorghumliquorwastessupplementedwithstarch.Biotechnologyletter,2001,23:331耀3332N.E.Ward,J.W.Wilson.PelletingstabilityofRonozymeTMPCTphytaseincommercialfeedmills.PSANutrition:PhytaseandGeneralNutrition.Abstract,1998.4793N.E.Ward.Phytasestabilitymaybeimprovedbynewtechnology.Feedstuff.2002,