发酵工艺控制

第七章发酵工艺控制种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备发酵的一般流程提纲温度控制pH值控制溶氧控制二氧化碳控制泡沫的控制1、温度对发酵的影响对细胞生长的影响：温度升高，从酶反应动力学来看，生长代谢加快，但由于酶很容易热失活，所以高温时菌体易于衰老；对产物形成的影响：菌体生长速率、呼吸强度和代谢产物形成速率的最适温度往往是不同的；温度升高，一般产物生成提前；对生物合成的方向的影响：反馈抑制随温度变化而改变；对发酵液物理性质及溶解氧的影响：影响氧的溶解和传递，影响一些基质的分解，间接影响生物合成。2、影响发酵温度的因素发酵热的成分生物热：微生物生长繁殖过程中的产热搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量显热：空气流动过程夹带着的热量Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发Q显-Q辐射3、发酵热的测定①通过冷却水进出口温度和流量测定：Q发酵=G·cw·(t1-t2)/VG—冷却水流量；Cw—水的比热；V—发酵液体积。②通过发酵液温度随时间上升的速率测定：Q发酵=(M1c1+M2c2)·SM1、c1—发酵液质量、比热；M2、c2—发酵罐质量、比热；S—温度上升速率。4、最适温度选择与发酵温度控制温度变化的一般规律与控制的一般原则接种后发酵温度有下降趋势，此时可适当升高温度，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖；待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段，温度应控制在比最适生长温度低些，即代谢产物合成的最适温度；到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降）；生长阶段；培养条件等。4、最适温度选择与发酵温度控制—最适温度选择最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度。如：青霉素分别为：30℃和24.7℃。青霉素发酵的温度控制0-5h：30°C6-35h：25°C36-85h：20°C86-125h：25°C053585125302520254、最适温度选择与发酵温度控制—发酵温度控制进行温度控制时应考虑的因素不同菌种在不同生长阶段的生长和生产特性参考其它发酵条件（通气、培养基成分和浓度、pH值等），如通气条件差时，则最适发酵温度比通气良好时低。4、最适温度选择与发酵温度控制—发酵温度控制温度控制的方法冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷媒(盐水)进行降温。发酵罐的热交换装置：罐外夹套罐内蛇管、列管二、pH值对发酵的影响及控制发酵液pH对菌体生长、繁殖和产物积累影响较大。生产前应进行试验和研究。菌体生长、繁殖和产物积累的最适pH不一定相同。整个发酵过程的pH是变化的。1、pH对发酵的影响2、影响发酵pH的因素3、最适pH的选择和调节1、pH对发酵的影响微生物生长最适pH值范围不同的微生物具有不同的最适生长的pH值。细菌6.5-7.5；放线菌6.5-8.0；霉菌4.0-5.8；酵母菌3.8-6.0产物形成最适pH值范围微生物的生长和产物形成的最适pH值往往不同。少数一致，大多不同；有的偏高，有的偏低。1、pH对发酵的影响pH对微生物生长和产物形成影响的原因：pH值影响菌体形态，如壁厚薄、长径比；pH值改变使原生质膜电荷发生改变，影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的排出；pH值直接影响酶活性；pH值影响某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。pH影响生物合成的途径。如：黑曲霉pH=2-3时产柠檬酸；近中性时产草酸、葡萄糖酸。2、影响发酵pH的因素影响pH值的因素：培养基成份、微生物代谢特性决定发酵过程的pH变化。（综合反映）此外，通气状况的变化，菌体自溶和杂菌污染都可能引起发酵液pH的变化。微生物改变培养液pH以适合自身生长的能力很强。发酵液的实际pH是“成分”和“途径”的统一。确定和有效控制pH在菌体生长或产物积累的最适范围是高产的保证。2、影响发酵pH的因素生理碱性物质和生理酸性物质生理碱性物质：经微生物代谢后，导致pH上升（碱性物质生成或酸性物质消耗）的物质。如：有机氮源，硝酸盐，有机酸。（产NH3、NaOH）生理酸性物质：经微生物代谢后，导致pH下降（酸性物质生成或碱性物质消耗）的物质。如：糖类（产有机酸），脂肪（产脂肪酸），铵盐（氧化产硫酸）。3、最适pH的选择和调节最适pH的选择和调节的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又可最大限度的获得高产。根据不同微生物的特性，在发酵过程中随时检查pH值的变化，选用适当的方法进行调节。生长最适pH和产物形成最适pH的相互关系：①两者相同，范围都宽；容易控制。②两者相同，范围都窄；必须严格控制。③两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。④两者不同，范围都窄；分别严格控制。3、最适pH的选择和调节选择pH值的方法：通过实验确定。配制并始终调节控制不同pH，检出菌体或产物最大值。调节pH值的方法：主要考虑培养基中生理酸、碱性物质的配比；补料调节：调节通气量、调整盐类、氮源、碳源的配比平衡；如：青霉素生产的葡萄糖补加控制pH。（按需补糖比恒速补糖效果好。）添加弱酸或弱碱、加缓冲剂。（一般效果不好）三、氧对发酵的影响氧是制约发酵进行的重要因素氧难溶于水，培养基中贮存的氧量很少；【纯氧溶纯水，1.26mmol/L；空气氧溶纯水，0.25；培养基更低】高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短加剧了对氧的需求；形成产物的最佳氧浓度和生长的最佳氧浓度有可能是不同的；发酵罐中氧的吸收率很低；（多数＜2%；通常＜1%）加大通气量会引起过多泡沫；消泡剂不利于氧的溶解。1、氧的传递和传质方程式①氧传递的阻力：气相到气液界面；气液界面；通过液膜；液相；细胞或细胞团表面液膜；固液界面；细胞团内；细胞壁；反应（生化）阻力。从空气泡到细胞内总阻力为上述阻力之和。即1/kt=1/kG+1/kI+1/kL+1/kLB+1/kLC+1/kIS+1/kA+1/kW+1/kR液相主体到细胞壁，氧的浓度差很小。（细胞不结团时，壁氧的浓度与液膜接近）。1、氧的传递和传质方程式氧传递的总推动力：气相与细胞内的氧分压差和浓度差。减小阻力方法：★液膜，气液混合所生湍动；细胞团表面液膜，搅拌减小外径，减少阻力；★细胞团内阻力和壁阻力，搅拌减少逆向扩散梯度；反应阻力，培养基成分，培养条件，产物移去。1、氧的传递和传质方程式②气液相间的氧传递和氧传质方程式。（氧分压和浓度变化图7-7）氧传递的主要阻力存在于气膜和液膜中。单位体积培养液中的氧传递速率：OTR=KLα（C*-CL）KLα—容积传递系数；α—比表面积；KL—以氧浓度为推动力的总传递系数；C*—气液平衡的液相氧浓度（应有）；CL—液相主体氧浓度（存在）。气液相间的氧传递和氧传质方程式培养物处于充裕的通气情况下，CL会逐渐接近C*，氧传递速率渐小；而处于不充裕的通气情况下，CL下降趋于0，氧传递速率最大。（C*-CL—推动力）2、影响微生物对氧需求的因素不同微生物对氧的需求不同，其耗氧速度用呼吸强度（比耗氧速率）来表示：CLQO2=(QO2)m————(当氧是限制性基质时)K0+CL(QO2)m——最大比耗氧速率；CL——溶解氧浓度；K0——氧的米氏常数。各种菌的K0和(QO2)m有定值（表7-3；表7-4）。影响微生物对氧需求的因素菌的呼吸强度与菌种种类[K0，(QO2)m]和培养液中溶解氧浓度有关。CL增加，QO2增强；直至达到[CL/（K0+CL）≈1]临界值，再不加大。如：图7-8。2、影响微生物对氧需求的因素摄氧率：单位体积培养液，在单位时间内耗氧量。r=QO2·XX—细胞浓度。氧的满足度：溶解氧浓度与临界氧浓度之比。产物形成的最佳氧浓度有时与细胞生长最佳氧浓度不同，需氧量差别较大，各有不同。影响微生物摄氧率的因素①菌种；②溶解氧浓度；③细胞浓度；④培养基成分和浓度：如：碳源，利用速度不同摄氧率不同；⑤pH；⑥温度：温度高，临界值增高；⑦有毒物积累。抑制呼吸；⑧挥发性中间物（有机酸），加强。3、培养基的流变特性培养基的流变特性影响：动量、热量、质量传递，继而影响各种发酵条件。如：溶氧速率、气体交换、发酵温度、营养物补充、PH值的调节等。培养液是一多相体系，由液相、固相（菌体，不溶性培养基组分）和气相构成。①牛顿流体和非牛顿流体牛顿型流体：服从牛顿黏性定律，黏度只是温度的函数，与流变状态无关。即发酵罐中任何局部黏度相同，与搅拌速度、半径无关。（清细菌、酵母液）非牛顿型流体：不服从牛顿黏性定律，其黏度不仅受温度影响，而且随流动状态而异。可分为几种类型的流体。与切变率r有关。（放线菌、霉菌、高浓度细菌、酵母培养液）②非牛顿流体的搅拌功率罐中非牛顿流体的平均切变率与搅拌速度成正比。_平均切变率r=kNk—无因次常数N—搅拌器转速对不同的非牛顿流体，采用不同型式和大小的搅拌器，k值一般在10-13之间。在发酵过程中，培养液的黏度系数K、流变特征指数n表现出时变性。4、影响供氧的因素由氧传质方程式：OTR=KLα（C*-CL）可知，以下因素影响氧传递速率：（1）影响KLα的因素；（2）影响推动力（C*-CL）的因素。（1）影响KLα的因素①搅拌：汽泡变小，增大汽液相接触面积；延长汽泡在液体中的停留时间；增加湍动程度，减小气泡外液膜厚度，减小阻力；使培养基成分和细胞均匀分布，利于营养物吸收，代谢物扩散。搅拌比通气速度对KLα的影响更明显。但搅拌速度过高，会对细胞造成损伤，并会增加传热的负担。通气效率还与罐体积（越小越好）、罐形状、结构、搅拌器形式、挡板有关。（1）影响KLα的因素②空气流量：供氧，带走废气。KLα随空气流量增加而增加，但有限度。如超过限度，搅拌器在空气泡中空转，不能分散空气，搅拌功率下降。气沿轴逸出。（1）影响KLα的因素③培养液性质的影响：微生物生长繁殖和代谢可引起发酵液密度、黏度、表面张力、扩散系数的变化。这些性质的变化都会影响KLα值。如：黏度增大，滞留液膜厚度增加，传质阻力增大；同时黏度影响扩散系数，使通气效率降低。综合操作条件和流体性质对KLα的影响，有：KLα=f(Di,N,ωs,DL,µ,ρ,σ,g)（1）影响KLα的因素④微生物生长的影响：细胞浓度增加，KLα值变小，细胞浓度相同时，球状菌悬液的KLα值是丝状菌悬液KLα值的两倍。（流动特性，稠度差别较大）（1）影响KLα的因素⑤消沫剂的影响：分布于气液截界面，增大传递阻力，使KL下降（虽使α增大）。产生泡沫原因多样，其中发酵性泡沫氧低，CO2高，不易破，“逃液”。消沫剂虽然使KL下降，但最终会有效的改善发酵液的通气效率。（消泡沫的重要手段）（1）影响KLα的因素⑥离子强度的影响：气泡在电解质溶液中，比在水中小很多，α较大，KLα值也比水大。并随浓度增加而增大。丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂也有类似情况。（2）影响推动力的因素提高推动力实际上是增加氧的饱和度C*。影响因素有：①温度：常压下，随温度升高而降低。②溶质的影响：随浓度增加氧饱和度下降。电解质，因盐析作用而降低；有机溶液，升高。③罐压：罐压增加，溶解氧浓度增加，但CO2也增加且更快。不利于液相中CO2排出。对细胞渗透压有不利影响。④纯氧：富氧通气、溶解氧增加。但生产成本提高，不够经济。5、液相体积氧传递系数KLα的测定常握供氧，需氧情况，要测定：溶解氧浓度，摄氧率和液相体积氧传递系数KLα。1.摄氧率的测定：先用纯水标定电极，得单位电流值代表的溶解氧浓度；测定时、关气、除气、保持搅拌；细胞耗氧，培养基氧降，电流值降，摄氧率r求出。5、液相体积氧传递系数KLα的测定2.液相体积氧传递系数KLα的测定：可用直接测定法，动态测定法。用复膜氧电极测定，停气、N气、除气，保搅拌；溶氧下降，到呼吸临界氧浓度时，恢复通气。溶解氧浓度为纵坐标，测定时间为横坐标。制得曲线，其斜率=-1/KLα；延长线与纵轴的截距为C*。6、提高溶