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第1页共27页目录综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵综合实验三甜酒的酿造第2页共27页综合实验一土壤中稀有放线菌的分离和纯化及抗生菌的体外抗菌鉴定一土壤中稀有放线菌的分离和纯化1实验目的了解采集土样的要求和方法，掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术，学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。2实验原理筛选放线菌是新抗研究的重要课题之一。迄今为止，已发现的抗生素有80%皆来自于放线菌。放线菌主要存在于土壤中，并在土壤中占有相当大的比例。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。通常，随着地理分布、植被及土壤性质的不同，放线菌的种类、数量和拮抗性也各不相同。土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得少量稀有放线菌。3仪器和材料（1）培养基：葡萄糖天门冬素琼脂，精氨酸琼脂，高氏1号琼脂，以上每种培养基皆用500ml三角瓶分装250ml。（2）灭菌物品：牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶分装90ml无菌水（含30粒玻璃珠），18×180mm试管分装9ml无菌水，牙签，玻璃刮铲，18×180mm试管中分装10ml1‰K2Cr2O7母液。（3）其它：采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔。4试验步骤（1）采土：选择适宜采样地点。用采土铲去除表土，取5～10cm深处的土壤约150g左右，装入无菌牛皮纸袋中，并注明采样日期、地点、土壤类型、植被和采样人姓名等。第3页共27页（2）土样预处理：新鲜土样应适当风干，并喷施小剂量杀虫剂以防培养过程中虫卵发育的影响。（3）制备平板：每组取10套无菌培养皿，将冷却至50℃左右的各培养基，分别倒入平皿，每皿约15～20ml。每种培养基中需加入20ppm的K2Cr2O7溶液。在皿盖上注明培养基种类及组号。（4）制备土壤稀释液：每组称取10g土样，放入90ml无菌水中，得到土壤原液。手摇15～20min后，静置1min。再用无菌吸管取1ml上清液，置于9ml无菌水中，充分混匀，则得到10－2稀释液。依此类推，制备10－3、10－4稀释液（一般地，较肥的土壤使用10－3～10－5稀释液，而瘦土则使用10－2～10－4稀释液）。（5）铺平板：用1ml无菌吸管分别取0.1ml10－3～10－5稀释液，置于培养基平板中央。然后，再用无菌的玻璃刮铲均匀涂布，静置10min。每1稀释度3个重复，每1种培养基10套平板。并注明各稀释度。（6）培养及观察：将各平板置于28℃恒温箱中倒置培养14天。要求分别在第2天、7天和14天进行观察，并根据菌落大小、气生菌丝有无、气生菌丝和基质菌丝的颜色及可溶性色素有无等培养特征，选择单菌落放线菌进行纯培养，同时在平板背面的相应位置上作好标记。（7）纯培养：及时将选定的单菌落接入高氏1号琼脂斜面，每个菌株接1支斜面。必要时，中间可加1次划线分离培养，然后再转斜面。5结果与讨论将实验结果填入下表。思考题1、在分离土壤放线菌时为什么要选用多种培养基？2、在培养基中添加K2Cr2O7有何作用？第4页共27页二抗生菌的体外鉴别1实验目的了解抗生素产生菌体外筛选法的原理，学习并掌握抗生菌的鉴别方法。2实验原理由土壤中分出的放线菌需进一步鉴别是否为需要的抗生菌。首先应根据筛选目的确定试验模型，然后利用培养基平板进行拮抗性测定。常用的方法有琼脂块法和滤纸片法。其主要依据是扩散原理，即观察在抗生菌周围是否会出现明显的抑菌圈。抑菌圈的大小和透明度则表明了该菌株抗菌活性的强弱。本实验选用了这两种方法。3仪器与材料（1）培养基：500ml三角瓶中分装300ml黄豆饼粉琼脂，18×180mm试管分装4ml黄豆饼粉浸汁，300ml三角瓶分装150ml细菌培养基，150ml三角瓶分装50ml马铃薯培养基。（2）试验菌：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）大肠杆菌（Escherichiacoli）金黄色葡萄球菌（Staphlococcusaureus）深红酵母（Ruodotorularubra）（3）待测菌株：琼脂培养物：将融化的黄豆饼粉琼脂倒入无菌培养皿，制成平板。用记号笔在平皿背面画一直线，将平皿一分为二，分别注明待测菌株的编号。并按照编号将待测菌株密集划线接入平板。同法接入华美链霉菌（Streptomycessplendens）和金霉素链霉菌（Streptomycesaureofaciens）作为对照菌，28℃下培养7天发酵液：将待测菌株和对照菌分别接入黄豆饼粉培养液，作好标记，28℃下振荡培养7天。（4）灭菌物品：培养皿，打孔器，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管分装5ml无菌水，1ml吸管，无菌漏斗。（5）其它：接种用具，游标卡尺，记号笔，摇床。4试验方法4.1琼脂块法（1）分别取枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌各1支，加入5ml无菌水制成菌悬液，备用。第5页共27页（2）取9套无菌培养皿，向每套培养皿中分别加入1ml试验菌悬液，然后加入约12ml冷却至45℃左右的细菌培养基，迅速在实验台上摇匀，制成指示菌平板。每1种指示菌3个重复，并注明指示菌及测定菌株的位置。（3）用无菌打孔器将待测菌株和对照菌的黄豆饼粉琼脂培养物切块，每种培养物9块。（4）用无菌接种针，将待测菌株和对照菌琼脂块分别移入各指示菌平板的相应位置上，菌面朝上，间隔均匀摆放。（5）静置20min后，放入恒温箱，37℃下培养18～24h。（6）用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。4.2滤纸片法(1)向深红酵母菌斜面中加入5ml无菌水，制成菌悬液。(2)向已冷却至45℃左右的马铃薯培养基中加入0.5ml深红酵母菌悬液，摇匀后，倒3个指示菌平板，并在平皿背面标明测定菌株的位置，备用。(3)过滤各测定菌株的发酵液。(4)用无菌镊子取无菌的圆滤纸片，蘸取各测定菌株的发酵滤液，放入指示菌平板的相应位置上，每1测定菌株3个重复。(5)静置20min后，28℃下培养2天。(6)用游标卡尺测量抑菌圈直径，并观察抑菌圈的透明程度和边缘整齐程度。5结果将实验所得结果填入下表，抑菌圈直径以mm来表示。思考题1、为什么在移入琼脂块和滤纸片后不立即保温培养？2、抑菌圈小是否就意味着菌株的抑菌活性差？为什么？第6页共27页实验进度安排第一天：设备准备，土壤采样，培养基准备第二天：培养基准备，分离稀有放线菌体第三天：土壤稀释法和微生物的纯培养第四天：琼脂块法筛选，滤纸片法筛选培养第五天：实验结果观察总结报告撰写第7页共27页综合实验二玉米淀粉液化、糖化及酒精发酵1实验目的及要求要求学生掌握用酶法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法，淀粉水解糖酒精发酵方法。掌握粗淀粉含量和还原糖、酒精含量的化学测定方法。2实验原理发酵过程中，有些微生物不能直接利用淀粉，因此，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖。发酵生产中，淀粉水解糖液的质量，与生产菌的生长速度及产物的积累直接相关。可以用来制备淀粉水解糖的原料主要有薯类(木薯、甘薯)淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉等，根据原料淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，水解淀粉为葡萄糖的方法可分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。实验室中常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两步：第l步是利用α-淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第2步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。利用酒精酵母将可酵糖转化为酒精的过程称为发酵。2.1酶法液化原理淀粉的酶法液化是以α-淀粉酶为催化剂，该酶作用于淀粉的α-1,4糖苷键，从内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，其碘色反应发生如下变化：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。酶法液化以生产工艺不同分为间歇法，半连续和连续式；液化设备有：管式、罐式、喷射式。加酶方法有：一次加酶、二次加酶、三次加酶。根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法、或中温酶和高温酶混合法。本实验采用：中温酶法，间歇式，罐式，二次加酶法。2.2酶法糖化原理淀粉的糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非还原末端以葡萄糖为单位顺次分解淀粉的α-1，4糖苷键或α-1，6糖苷键。因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中，水参与反应，故糖化的理论收率为111.1％。（C6H10O5)n+H2OnC6H12O616218180淀粉糖化实际收率的计算：淀粉转化率：淀粉-葡萄糖转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖。淀粉转化率的计算：%100(%))(原料中纯淀粉含量投入淀粉量糖液葡萄糖含量糖液量收率L%10011.1(%))(原料中纯淀粉含量投入淀粉量糖液葡萄糖含量糖液量转化率L第8页共27页DE值：用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。DE值计算：还原糖用裴林氏法或碘量法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液；干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。影响DE值的因素：糖化时间：最初糖化时，糖化速度快，DE值显著上升；但24h后，当DE值达到90％以上时，糖化速度显著放慢。液化DE值与糖化DE值的关系：液化程度应控制适当，太低或太高均不利。原因是液化程度低，则粘度大，难操作；同时，由于液化程度低，底物分子少，水解机会少，影响糖化速度；液化程度低，易发生老化；但液化超过一定程度，则不利于糖化酶与糊精生成络合结构，影响催化效率，造成糖化液的最终DE值低。故应在碘试本色的前提下，液化DE值越低，则糖化液的最高DE值越高。一般液化DE值应控制在12-18％。酶制剂用量与糖液DE值的关系：糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间（h）68101624324872糖化酶用量（U/g淀粉）480400320240180150120100为加快糖化速度，可以提高酶用量，缩短糖化时间。但酶用量太高，反而使复合反应严重，最终导致葡萄糖值降低。在实际生产中，应充分利用糖化罐的容量，尽量延长糖化时间，减少糖化酶用量。2.3酒精发酵原理以淀粉为原料，采用酸水解、酸酶结合水解或酶水解方法，可以将淀粉转化为葡萄糖等可酵糖。利用酒精酵母胞内的酒化酶系，葡萄糖被转化为酒精即酒精发酵。以生产工艺不同，酒精发酵可分为间歇式、半连续式、连续式过程，各种过程又可以细分为多种形式。本实验采用酶法糖化、一次添加间歇式方法进行酒精发酵。3实验仪器、设备和材料（1）1000ml烧杯（2）真空过滤装置（3）烘箱（4）量杯（5）量筒（6）分光光度计（7）水浴锅（8）滴定管（9）电炉（10）白瓷板（11）三角瓶（12）阿贝折光仪（13）玉米粉（14）α-淀粉酶（15）糖化酶%100%%）干物质含量（）还原糖含量（值DE第9页共27页（16）pH试纸（17）酒精活性干酵母（18）酒精蒸馏装置及酒精计4实验步骤4.1淀粉水解糖的制备4.1.1淀粉的液化配制30％的淀粉乳，调节pH值至6.5，加入氯化钙(对固形物0.2％)，在3个1000ml烧杯中分别加入淀粉乳700ml并分别加入液化酶12U/g淀粉、16U/g淀粉、20U/g淀粉，在剧烈搅拌下，先加热至72℃，保温15min，再加热至80℃~90℃（视酶的特性