家蚕蛹蛋白精制工艺的研究

西南大学硕士学位论文家蚕蛹蛋白精制工艺的研究姓名：陈亮申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：吴大洋20080601家蚕蛹蛋白精制工艺的研究作者：陈亮学位授予单位：西南大学相似文献(7条)1.期刊论文陆洪省.冯晓寒.陆洪彩蚕蛹资源的开发和利用-世界农业2003,(2)蚕蛹(silkwormpupa)是家蚕(BombyxmoriL.)生命周期中的一个发育阶段,它含有蛹油、蛹蛋白、蛹核酸和几丁质等成分.2.学位论文舒特俊家蚕类核质蛋白基因的研究2007核质蛋白(nucleoplasmin)是高等真核生物卵母细胞和卵细胞核中重要的分子伴侣，体外实验证明核质蛋白在核小体的装配、精子染色质重建以及细胞凋亡的染色质聚缩过程中具有重要的调节作用。在对家蚕蛹期cDNA文库测序中，我们获得一条cDNA序列长度为1183bp，其编码的氨基酸序列与已知的核质蛋白序列共有一个保守的结构域。该保守结构域有约100个氨基酸残基，同源性达61.1﹪。我们将它命名为家蚕类核质蛋白BmNLP(nucleoplasmin-likeproteinfromBombyxmori)，Genbank登录号为EF210318。该基因的开放阅读框全长486bp，编码的蛋白有161个氨基酸残基，预测分子量为18.2kDa，等电点为4.33。将其ORF克隆到原核表达载体pET-28a中，构建重组质粒，双酶切鉴定及序列测定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导，该基因得以成功表达。表达的重组蛋白以可溶形式存在，经过镍柱亲和层析纯化后，以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔获得该蛋白的多克隆抗体，经ELISA检测，抗体效价可达1∶25600以上。ELISA和Westernblot检测蚕蛹蛋白，反应都呈阳性，进一步证实了BmNLP的存在。利用该抗体以Westernblot检测家蚕三个发育阶段和五龄幼虫四种组织或器官中BmNLP蛋白的表达和分布，发现在卵、五龄幼虫、蛹三个发育阶段均有表达，表达量比较接近；各个组织或器官中，在头部表达最少，其次是中肠，而丝腺中表达最多。利用抗体的免疫荧光标记对家蚕Bm5细胞定位，观察到荧光集中分布在细胞内一个近似圆形的区域，以DAPI复染后确定为细胞核，从而证实BmNLP定位在细胞核中；利用激光断层扫描发现间期细胞中BmNLP分布更靠近核膜，而分裂细胞中整个核都有分布。此外，以该基因的ORF为模板体外转录dsRNA，琼脂糖凝胶电泳检测后，脂质体法转染Bm5细胞，48h后以MTT法检测干扰前后细胞活力，同时提取细胞总蛋白作ELISA检测，RNA干扰后的细胞活力下降，总蛋白中目的蛋白含量明显低于阴性对照；将细胞用PI染色后流式细胞仪分析，与正常细胞相比，干扰后的细胞在S期出现一个检测峰，表明细胞被阻滞在这一时期。3.学位论文王浩蚕蛹蛋白肽的制备及其功能活性研究2007蛋白质是由各种氨基酸相互联接而构成的具有空间结构的生物大分子，其理化性质和功能特性直接相联系。蛋白质改性就是用生化因素或物理因素使氨基酸和多肽链发生某种变化，引起蛋白质大分子空间结构和理化性质的改变，从而获得较好功能特性和营养特性的蛋白质。肽是由两个以上的氨基酸分子联结而成，是构成蛋白质的结构片段，也是蛋白质发挥作用的活性基因部分，是机体完成免疫功能和进行免疫调节的重要活性物质。生物活性肽指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称，大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，当被酶解成适当的长度时，它们的生理活性才会表现出来。蚕蛹(silkwormpupa)是家蚕(AnthereapernyiGuerin-Meneville)生命周期的一个阶段，蚕蛹蛋白与蚕蛹肽含有60％以上的人体必须氨基酸，还富含多种营养素，具有补充机体营养、促进生长发育、抗疲劳、抗衰老、提高人体免疫力等多种功能。本文主要对超临界CO,2萃取技术提取蚕蛹油制备蚕蛹蛋白粉的最佳工艺条件进行了研究，以得到的蚕蛹蛋白粉为原料进行蚕蛹蛋白肽的最佳酶解条件研究，并对蚕蛹蛋白肽进行分离纯化、分子量测定及功能活性研究。首先进行蚕蛹蛋白粉的制备，采用超临界CO,2萃取技术对蚕蛹进行脱脂处理，以蚕蛹油提取率为指标，采用三因素三水平正交试验设计确定超临界CO,2萃取蚕蛹油的最佳工艺条件为：萃取温度45℃，压力25MPa，时间180min。蚕蛹油提取率为95.99％。蚕蛹蛋白肽的水解过程中，首先进行酶的筛选，在各自的最适条件下进行酶解，以水解度(DH)为指标，确定了最佳酶制剂为2709碱性蛋白酶。试验考察了pH值、时间、温度、固液比、加酶量对水解蚕蛹蛋白肽的影响，在单因素试验的基础上，采用L,16(4'5)正交试验确定了蚕蛹蛋白肽的最佳酶解工艺条件为：温度为55℃，时间为2.5h，固液比为1:7，pH值为8，酶与底物比为7％。蚕蛹蛋白肽的水解度为29.97％。由于在酶解过程中，为了保持其在最适pH值范围内，需加入酸、碱，产生了大量的盐，而且得到的蚕蛹蛋白肽颜色较深，蚕蛹蛋白肽需精制处理。通过添加3％活性碳进行脱色、脱苦，可获得色清、味好的蚕蛹蛋白肽。通过阴阳离子交换树脂可除去91.20％的盐分。试验对精制后的蚕蛹蛋白肽理化性质和功能活性进行了研究，通过凝胶过滤层析技术得到蚕蛹蛋白水解液的洗脱曲线为一单一对称峰，说明水解液的多肽纯度较高、是由分子量接近的多肽组成的。通过SDS-PAGE电泳法检测分子量分布，发现蚕蛹肽分子量在3000道尔顿左右。抗疲劳动物活性试验结果表明，蚕蛹蛋白肽具有抗疲劳的活性功能，在功能性食品的应用中具有深远意义。4.期刊论文林高堂.蒋立文.LINGao-tang.JIANGLi-wen蚕蛹综合利用研究进展-蚕桑通报2006,37(2)概述了蚕蛹的化学成分.综述了利用蚕蛹制备蚕蛹蛋白粉和多肽,分离家蚕抗菌蛋白和诱导生产生物活性蛋白,生产蚕蛹氨基酸及氨基酸络合物,提取蚕蛹油与壳聚糖,开发蚕蛹蛋白纤维、蚕蛹虫草等方面的研究进展.探讨了蚕蛹及其产品在食品、医药、化工、生物防治等领域的应用现状及前景.5.学位论文杨梅琳蚕蛹蛋白的酶法水解及其产物的抗氧化性研究2006蚕蛹(Silkwormpupa)是家蚕(BombyxmoriL.)生命周期中的一个发育阶段。蚕蛹蛋白与蛹肽含有60％以上的人体必须氨基酸，还富含多种营养素，具有补充机体营养、促进生长发育、抗疲劳、抗衰老、提高人体免疫功能等多种功能。本文以蚕蛹蛋白为原料，主要研究了蚕蛹蛋白酶解产物在抗氧化方面的活性，优化了酶解工艺，分离、纯化、制备出活性物质，并对活性物质进行了分析和鉴定。首先研究了蚕蛹脱脂蛋白的制备，从五种常用有机溶剂中选择了正己烷作为萃取剂，并优化蚕蛹脱脂工艺，得到了高纯度的蚕蛹脱脂蛋白。分别利用protamex复合蛋白酶、Flavourzyme复合风味蛋白酶、GC710中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、Alcalase碱性蛋白酶、复合胰蛋白酶等六种蛋白酶对脱脂蚕蛹蛋白进行水解，研究酶解产物的生物活性，结果发现六种蚕蛹蛋白酶解产物的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性水平均较低，但具有较强的清除1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH·)、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-)的能力，其中木瓜蛋白酶酶解产物清除自由基的能力最强。研究了pH、温度、加酶量、底物浓度等条件对蚕蛹蛋白水解度(DH)以及酶解液清除DPPH·、·OH和O2-的能力的影响。酶解液清除DPPH·、O2-和·OH的能力与其水解度的关系均表现为相似的趋势。通过响应面分析，分别获得酶解液清除DPPH·、O2-和·OH活性的最佳酶解工艺条件(样品浓度：30mg/mL)：(1)当pH=7.36、T=49.78℃、E/S=2.17％、t=1.90h，酶解液清除DPPH·的能力最强，清除率高达92.38％；(2)当pH=7.48、T=50.23℃、E/S=2.00％、t=1.41h，酶解液清除O2-的能力最强，清除率为48.56％；(3)当pH=7.58、T=49.95℃、E/S=2.10％、t=2.03h，酶解液清除·OH的能力最强，清除率i=93.97％。采用SephadexG-25凝胶过滤色谱分离纯化蚕蛹蛋白酶解产物(SHOC)，得到了P1-P4四个组分，其清除DPPH·的能力为：P4＞P3＞P2＞P1，且P4清除DPPH·的能力为P3的3～4倍。分别收集P4的前半峰(P4F)和后半峰(P4L)并测定其清除DPPH·的能力，结果发现其自由基清除率分别比酶解液提高了5.28倍和6.49倍，且P4L清除DPPH·的能力与VC相当，IC50(清除DDPH·50％所需加入清除剂的浓度)达到0.1524mg/mL。利用RP-HPLC对P3、P4F、P4L进行了分析，发现P3组成较为复杂，难以进一步分离纯化；进一步利用LC-MS对P4F，P4L进行组成分析和结构鉴定。发现P4F中的两个主要组分P4F2，P4F3的分子量分别为168和222，其中P4F3为二肽Phe-Gly；P4L中的主要组分P4L1与P4F2的质谱图完全一样，分子量均为168，因此为同种物质。进一步利用反相高压液相色谱C18制备柱制备活性物质P4F2、P4F3，并通过冷冻干燥得到了这两种物质。测定P4F2、P4F3清除DPPH韵能力，发现P4F2(Mw168)和P4F3(Phe-Gly)在1mg/mL的浓度下对DPPH·的清除率分别为49.80％和28.50％，且两者之间没有协同效应。6.期刊论文王敦.白耀宇.张传溪家蚕蛹营养成分及其开发利用研究进展-昆虫知识2004,41(5)总结了家蚕BombyxmoriL.蛹的蛋白质、脂肪酸和几丁质等营养成分含量及其特点.系统介绍了家蚕蛹蛋白、脂肪酸和几丁质等成分的提取技术和相关生产工艺.概述了家蚕蛹作为保健食品与饲料原料开发状况和食用安全性.并对家蚕蛹营养成分利用与产品开发前景进行了展望.7.学位论文赖泰君蚕蛹多糖的提取分离研究2009蚕蛹（Silkwormpupa）为蚕蛾科昆虫家蚕蛾（BombyxmoilL．）的蛹，为药膳同源传统中药材，具有很高的营养和药用价值。蚕蛹多糖是蚕蛹中的主要成分之一，具有增强机体免疫力的作用。目前，关于蚕蛹的研究主要集中在蚕蛹蛋白成分上，而蚕蛹多糖的相关信息很少，特别是对蚕蛹多糖的提取、分离纯化未见任何系统的报道。本文对蚕蛹多糖的提取、分离纯化进行了系统的研究，论文主要内容和结果如下：br　　1．采用苯酚-硫酸法测定蚕蛹多糖含量。br　　2．以蚕蛹为原料，采用传统热水浸提法、微波辅助提取法以及超声波辅助提取法提取蚕蛹多糖，在单因素实验的基础上，采用正交设计对蚕蛹多糖的提取工艺进行优化。br　　确定传统水提最佳提取工艺参数：浸提时间10h，温度100℃，料液比1：10，多糖提取率为93.78％。br　　微波辅助提取最佳提取工艺参数：微波处理时间100min，功率600W，料液比1：15，多糖提取率为80.24％。br　　超声波辅助提取最佳工艺参数：超声处理时间40min，功率750W，料液比1：10，多糖提取率达到95.61％。比较不同提取方法，超声波辅助法提取蚕蛹多糖效果最好，明显缩短提取时间，降低能耗，提高蚕蛹多糖提取率。br　　3．采用不同的脱蛋白方法去除蚕蛹粗多糖中的蛋白质，并对各方法的脱蛋白工艺进行了优化，以蛋白去除率和多糖损失率为参考指标比较最佳参数下各个方法的脱蛋白效果。实验结果表明，木瓜蛋白酶-TCA联用法脱蛋白效果较好，在木瓜蛋白酶用量[E]/[S]为0.2％，酶解温度50℃的条件下酶解反应1.5h后，采用TCA法除蛋白一次，蛋白去除率达到97.98％，多糖损失率为18.76％。br　　4．对蚕蛹多糖进行了初步的分离纯化。实验确定了DEAE-SephadexA-25作为分离纯化的凝胶，对脱蛋白处理后的蚕蛹多糖进行柱层析分离，考察不同洗脱条件对蚕蛹多糖分离效果的影响。在上样量60mg，洗脱速度0.5mL·min-1，0～0.5mol·L-1NaCl溶液梯度沈